外源添加物对无核葡萄胚挽救及胚珠发育的影响

田淑芬，路凤珍，2，温晓敏，2，张娜，陈三春，2（. 天津市农业科学院葡萄研究中心/天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室，天津 30092；2. 天津师范大学生命科学学院，天津 300387）

外源添加物对无核葡萄胚挽救及胚珠发育的影响

田淑芬1，路凤珍1，2，温晓敏1，2，张娜1，陈三春1，2
（1. 天津市农业科学院葡萄研究中心/天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室，天津 300192；2. 天津师范大学生命科学学院，天津 300387）

为了研究部分外源添加物对无核葡萄胚珠发育及胚培养的影响，以红宝石无核×玫瑰香优系、希姆劳特×玫瑰香优系杂交胚为试材，研究了6-BA不同处理浓度、不同甘氨酸浓度和不同活性炭用量对胚珠生长发育的影响。结果表明，0.5 mg/L 6-BA浓度处理的红宝石无核×玫瑰香优系胚发育率最高，为15.89%；红宝石无核×玫瑰香优系最适甘氨酸浓度为4.00 mmol/L，胚发育率13.33%，1.00 mmol/L甘氨酸浓度处理对希姆劳特×玫瑰香优系杂交胚发育率最高，为17.33%；两组合最适活性炭浓度为1.0 g/L。

无核葡萄；6-BA；甘氨酸；活性炭；胚挽救

近年来，世界鲜食葡萄育种目标趋于大粒、无核、优质、香气、抗病。无核葡萄以其食用方便，且在鲜食和制干方面有独特优势，一直以来备受消费者的喜爱。无核品种的主要育种方法为有性杂交育种，传统杂交育种只能以有核品种为母本无核品种为父本，后代无核率低且选育一个无核品种所需的时间较长（10～20年），随着科学技术的发展，通过胚挽救技术获得无核葡萄新品种的方法被众多育种者［1-6］所采用。胚挽救及辅助育种技术的广泛应用，大大加快了培育优质无核葡萄的育种进度。在无核葡萄胚挽救中，胚珠发育培养基组分是影响胚挽救效率的关键因素，唐冬梅等［7］研究发现，在Nitsch基础培养基中添加6-BA能显著提高杂交胚的萌发率。陶建敏等［8］利用5 mg/L与10 mg/L两个浓度的6-BA，在花前两周对火星无核进行处理，得到的有胚种子率大于60%。郭修武等［9］在MS、ER、改良Nitsch、White培养基中分别添加6-BA均能提高胚挽救效率。本研究在前人研究的基础上探索细胞分裂素6-BA浓度、不同甘氨酸浓度和不同活性炭浓度对红宝石无核×玫瑰香优系、希姆劳特×玫瑰香优系2个杂交组合胚珠生长发育的影响，旨在确定适宜无核葡萄红宝石无核和希姆劳特为母本的胚挽救幼胚离体培养体系。

1　材料与方法

1.1试验材料

试验于2015年5月至2016年5月在天津市农业科学院葡萄研究中心武清试验基地、天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室进行。供试母本为红宝石无核和希姆劳特，其中红宝石无核是从皇帝×Pirovan075杂交后代选育出的晚熟无核品种。供试父本为玫瑰香优系，是由天津农科院葡萄研究中心采用生物分子标记技术与田间营养系混合选种方法相结合对茶淀玫瑰香葡萄提纯复壮，筛选出的玫瑰香优系葡萄。亲本特性见表1。

表1　 杂交亲本特性

1.2试验方法

1.2.1田间杂交及幼果采集

红宝石无核×玫瑰香优系、希姆劳特×玫瑰香优系杂交组合参照王爱玲等［10］的方法进行。

上述两组合分别在授粉后29 d、25 d开始取样。将采集的幼果带回实验室，剪去果柄，用自来水冲洗干净后放入超净工作台消毒：先用70%酒精冲洗一次，用无菌水冲洗3次，放入次氯酸钠中浸泡3 min，再用无菌水冲洗3次。用解剖刀切开浆果，取出胚珠，将其接种到发育培养基中进行胚珠发育培养。

1.2.2试验处理

试验选取两组合的杂交胚珠为试材，每个处理重复3次。接种30 d后调查胚珠发育率，然后进行剥胚处理，培养30 d后统计胚萌发率。

胚珠发育培养基：Nitsch+1.5 mol/L IAA+0.5 mol/L GA3+60 g/L蔗糖+5 g/L琼脂。

（1）胚珠发育基中添加不同浓度6-BA。以红宝石无核×玫瑰香优系杂交胚珠为试验材料，发育培养基分别添加0.2 mg/L、0.5 mg/L、0.8 mg/L、1.0 mg/L浓度的6-BA，空白试验为CK。

（2）不同甘氨酸浓度。以红宝石无核×玫瑰香优系、希姆劳特×玫瑰香优系杂交胚珠为试材，在胚珠发育阶段，甘氨酸浓度设定为：1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、4.0mmol/L、6.0 mmol/L和CK共5个处理。

（3）不同活性炭浓度。以参试两组合的杂交胚珠为试材，在发育基本培养基上，分别添加0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L浓度的活性炭。

1.3数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2016对数据进行处理，SPSS 17.0软件进行方差分析（P＜0.05）。

胚发育率/%=（发育胚数/接种胚珠数）×100

2　结果与分析

2.1不同浓度6-BA对杂交胚珠发育率的影响

在发育培养基中添加不同浓度的6-BA，对红宝石无核×玫瑰香优系胚珠发育率的影响不同（表2）。添加6-BA试验组的发育率均高于对照组，说明6-BA对胚珠发育具有促进作用。如表2所示，添加0.5 mg/L 6-BA的胚发育率可达到15.89%，显著高于其他试验组，说明在发育培养基的基础上，添加0.5 mg/L 6-BA适用于红宝石无核×玫瑰香优系的胚珠发育。

2.2不同甘氨酸浓度对杂交胚珠发育率的影响

添加不同浓度甘氨酸的胚发育培养基，对量组合胚挽救效率的影响不同（表3）。结果表明：添加甘氨酸能显著提高胚珠发育率，红宝石无核×玫瑰香优系在4.00 mmol/L水平上，胚的发育率可达13.33%，显著高于其他处理组。希姆劳特×玫瑰香优系在1.00 mmol/L、2.00 mmol/L水平上胚的发育率显著，分别为17.27%、17.33%。说明添加甘氨酸能显著提高胚珠发育率，不同杂交组合适宜的甘氨酸浓度不同。

表2　6-BA对红宝石无核×玫瑰香杂交胚珠发育率的影响

表3　不同甘氨酸浓度对杂交胚珠发育率的影响

2.3不同活性炭浓度对胚珠发育生长的影响

不同浓度的活性炭处理对胚珠发育的影响不同（表4）。结果表明：添加活性炭可以显著提高胚的发育率，不添加的仅为5.56%。添加活性炭的最佳浓度为1.0 g/L，两组合杂种胚珠的发育率均最高，分别为17.33%、15.69%，这说明添加1.0 g/L活性炭对胚的生长发育有明显促进作用。

表4　不同活性炭浓度对胚珠发育生长的影响

3　讨论与结论

适宜的外源激素的种类及适当的配比对胚珠和胚的培养效果有着重要影响。对激素的敏感程度会随着葡萄的品种变化和胚的发育程度的变化而呈现显著差异。多数学者认为，培养基中附加合适的外源激素对胚的发育有促进作用。唐冬梅［11］的研究认为添加0.2 mg/L 6-BA比不加6-BA的无核葡萄胚挽救成功率高，郭印山等［12-13］认为，幼胚的发育可能需要相对较低浓度的6-BA，采用White培养基+2.0 mg/L IBA+0.9 mg/L 6-BA+0.7 mg/L GA3培养87-1×京秀，成苗率高达95.08%。刘佳［14］研究表明，金星无核葡萄胚发育阶段适宜的6-BA浓度是1.0 mg/L。刘巧等［15］研究不同6-BA浓度对抗寒无核葡萄的影响，认为添加低浓度水平的6-BA有助于促进胚发育、萌发和成苗，且不同杂交组合对6-BA的敏感程度不同。本试验的研究结果表明，红宝石无核×玫瑰香优系最适6-BA浓度为0.5mg/L，胚发育率可达到15.89%，显著高于其他试验组。

氨基酸是胚形成和发育必不可少的营养物质。不同种类的氨基酸对胚发育的影响不同，一般认为，半胱氨酸（Cys）、丝氨酸（Ser）、谷氨酞胺（Gln）、天冬酞胺（Asn）、甘氨酸（Gly）能够促进葡萄胚珠内胚的发育。10 mmol/L甘氨酸有利于幼胚的发育和成苗［16］，田莉莉［17］研究发现，甘氨酸对底来特×北醇和爱莫无核×北醇胚发育和成苗都有促进作用。本研究结果表明，杂交组合不同，最佳甘氨酸浓度也不相同，红宝石无核×玫瑰香优系最适浓度为4.00 mmol/L，胚发育率13.33%，1.00 mmol/L甘氨酸浓度处理对希姆劳特×玫瑰香优系杂交胚发育率最高，为17.33%，2.00 mmol/L水平上胚发育率次之。

活性炭可通过吸附发生作用，对大多植物的幼胚培养都有明显的促进作用［18］。胚珠中含有酚类物质，在培养过程中易发生氧化作用而导致胚珠褐化。在培养基中加入一定量的活性炭可吸附有害物质，防止胚珠褐化［19］，但是活性炭的吸附作用属非选择性吸附，其在吸附有害物质的同时也会吸附营养物质，所以需要控制活性炭的浓度。田莉莉［17］研究发现，添加1.5 g/L的活性炭，有利于提高胚的发育率和成苗率。夏培培等［20］研究了活性炭对木纳格葡萄胚挽救的影响，结果表明，随着活性炭浓度的增加，胚萌发率为先增后减趋势，浓度为0.5 g/L时，萌发率达到最高。在本试验中添加适宜浓度的活性炭（1.0 g/L）可以显著提高胚的发育率，浓度过高会吸附营养物质，胚发育率降低。

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Effect of exogenous additives on embryo rescue and development of ovules of seedless grape

TIAN Shufen1，LU Fengzhen1，2，WEN Xiaomin1，2，ZHANG Na1，CHEN Sanchun1，2
（1. Grape Research Center， Tianjin Academy of Agricultural Sciences/Tianjin enterprise Key Laboratory of grape genetics and breeding， Tianjin 300192， China； 2. College of life science， Tianjin Normal University， Tianjin 300387， China）

The young ovules from Ruby Seedless×Muscat Hamburg， Himrod×Muscat Hamburg were taken as experimental materials， to investigate the effects of exogenous additives （6-BA， glycine and activated carbon）on ovule and embryo development of seedless grape. The results showed that the concentration of 0.5 mg/L 6-BA treatment gained the highest embryo development rate from Ruby Seedless×Muscat Hamburg， which was 15.89%；4.00 mmol/L glycine was the optimum concentrations for Ruby Seedless×Muscat Hamburg and 1.00 mmol/L glycine concentration was the best for Himrod ×Muscat Hamburg， the embryo development rate were 13.33% and 17.33%， respectively. The optimum concentration of activated carbon was 1.0 g/L for two combinations.

seedless grapes； 6-BA； glycine； activated carbon； embryo rescue

S663.1

A

10.13414/j.cnki.zwpp.2016.05.006

2016-08-02

天津市农业科学院院长基金（15010）

田淑芬（1966-），女，博士，研究员，主要从事葡萄栽培与选育种方面的研究。E-mail： tianshufen@263.net