分子标记技术在玉米种子纯度鉴定中的应用

李 晶，王雅琳，尹祥佳

（兰州职业技术学院 甘肃，兰州 730070）

玉米是我国重要的粮食作物，也是发展工业和畜牧业的优质饲料原料，在我国农业生产中处于非常重要的地位。玉米增产对粮食增产的贡献率近60%，居粮食作物之首[1]，我国2019年玉米播种面积达4128万公顷，总产量达到2.6亿吨。当前，我国处于实施乡村振兴战略的关键时期，提高粮食综合生产能力，保障农民种粮收益是促进农业技术发展，推动产业兴旺的重要途径，具有重要的经济和社会等现实意义[2]。作为我国第一大作物的玉米在这个发展进程中将发挥举足轻重的作用。

玉米是市场化程度最高的作物，玉米杂交种优势的利用有力的提高了我国玉米产量，但是也面临着一些问题，随着玉米杂交种商业化程度越来越高，种业企业的玉米种子生产质量成为了不容忽视的问题，而相关市场上出现了大量不合格的玉米种子，导致了玉米种植户减产，极大地损害了农户的利益，所以种子纯度鉴定越来越受到关注。种子纯度是种子质量的重要指标，是影响玉米种植产量和品质的关键因素。据统计，玉米种子纯度不合格率每增加1%，将造成每公顷减产损失214kg左右，减产率约为3%[3]。影响玉米杂交种纯度的主要因素有机械和生物学混杂，其中母本去雄不彻底、不及时是影响种子纯度的主要原因[4]。甘肃省是我国玉米杂交种生产的主产区，其中河西地区是我国重要的国家级玉米制种基地，常年制种面积稳定在10～13.3万公顷[5]。目前，甘肃省内推广的玉米品种数量近200个，因此快速、准确地检测玉米种子纯度是保障甘肃玉米种植业的关键环节，也能为落实“技能甘肃”，服务甘肃省乡村振兴战略提供技术支撑。

种子纯度鉴定方法有田间鉴定法、生化标记法和DNA分子标记法等。田间鉴定法是传统的鉴定方法，比较直观，但鉴定周期长，成本高，同时受季节、栽培措施及环境的影响。生化标记法则是利用同工酶、蛋白质电泳技术对不同品种蛋白质进行鉴定，鉴定过程经济、方便、简单，但结果易受发育期，取样部位和环境条件的影响，也很难区分亲缘关系比较近的杂交种。近年来，随着分子标记技术的迅速发展，使种子纯度鉴定进入了DNA水平，因其具有较高的准确性、稳定性和重复性，为作物品种纯度分析提供了更为准确、可靠、方便、快速的方法，所以被广泛应用于玉米自交系和杂交种纯度鉴定。因此，本文对RFLP、RAPD、AFLP、SSR和SNP五种分子标记技术在玉米杂交种纯度鉴定中的应用进行对比分析，为玉米种子纯度鉴定研究工作提供参考。

1 分子标记技术的原理和特点

分子标记技术是以DNA分子多态性为基础的一种遗传标记，是从DNA水平上进行多态性分析，从而反映基因型的差异。目前，分子标记技术主要用于玉米的遗传多样性分析，划分杂种优势群，主要性状的QTL定位，关联分析，指纹图谱构建，种子纯度鉴定等方面[6]。DNA分子标记鉴定玉米种子纯度是直接以种子的DNA片段作为研究对象，揭示子代与亲本间的遗传差异，弥补和克服了种子纯度的传统鉴定方法中的不足，具有以下显著优势：一是在玉米生长阶段均可检测，不受环境因素影响；二是能够检测微小的变异，操作简便，获得鉴定结果较快，数据稳定、可靠；三是DNA分子标记的数量多，遍及整个玉米10条染色体；四是多数标记共显性，能够鉴别出纯合体与杂合体基因型；五是分离出的样品DNA保存时间长，有助于进行追溯或仲裁[7]。目前，应用于玉米种子纯度研究的DNA分子标记主要有限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）、简单序列重复（SSR）和单核苷酸多态性（SNP）。其中，SNP作为第三代分子标记，因可精确到基因组中的单碱基突变，且具有丰富的多态性、易于高通量和自动化操作等优点，弥补了其它分子标记的不足，在玉米纯度鉴定方面深受关注。根据相关文献总结了5种分子标记技术的特点（表1—表5），能够有效加深对分子标记技术的了解。

表1 RFLP分子标记技术

表5 SNP分子标记技术

2 分子标记技术的应用

2.1 RFLP标记技术

限制性片段长度多态性（RFLP）是第一代分子标记技术，其原理是利用限制性内切酶酶切所提取的DNA，使DNA产生了长度不等、分子质量大小不同的片段，利用琼脂糖电泳把这些片段分离开，经特异性探针杂交可得到多态性的DNA片段，分析区别不同品种。RFLP标记为共显性，检测结果不受环境条件和植株发育阶段的影响，且具有多态性稳定、准确性高、重复性好等优点。Smith等[8]利用RFLP技术成功鉴定了78个玉米杂交种的纯度，这表明RFLP技术可以有效应用于种子纯度鉴定。但由于该技术操作程序繁琐、多态性低、对样品DNA需求量大，且检测中需要放射性同位素对操作人员身体有害，虽然目前已有非放射性同位素标记方法可选择，但由于价格昂贵严重影响了其推广，所以RFLP标记没有被大范围的应用于玉米杂交种纯度鉴定。

2.2 RAPD标记技术

随机扩增多态性（RAPD）是基于PCR反应的分子标记技术，它利用单一的随机寡聚核苷酸对不同品种的基因组DNA进行PCR扩增，再通过电泳分离检测DNA序列的多态性，从而鉴别不同的品种纯度。RAPD技术可直接对基因组进行多态性分析，且DNA用量较少、不需要进行复杂的分子杂交、快速简便，无放射性污染，成本低，分辨率和灵敏度高，所以在玉米品种纯度鉴定方面有所应用。颜廷进等[9]利用RAPD技术对10个玉米自交系和他们组配的7个杂交种进行纯度鉴定，结果表明该技术可以有效用于玉米纯种鉴定。陈一华等[10]利用RAPD分子标记技术构建了玉米自交系及其双亲的DNA指纹图谱，可快速、准确地鉴定杂交种的纯度。但是，RAPD分子标记技术对于不同引物之间的扩增结果重复性和稳定性较差，多态性仍显不足，对于以前未检测过的新品种，很难在短时间内筛选到合适的引物进行鉴定，且表现为显性，不能区分杂合型和纯合型。因此，该技术在玉米纯度鉴定中只能作为一种辅助技术，需要与其它技术结合使用。

表2 RAPD分子标记技术

2.3 AFLP标记技术

扩增片段长度多态性（AFLP）是基于聚合酶链式反应（PCR）与限制性酶切相结合的分子标记技术，兼具RFLP技术的可靠性和PCR技术的灵敏性。AFLP的基本原理是将基因组DNA经限制性内切酶酶切后形成不同分子量的随机限制片段，用PCR扩增后经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，即可显示限制性片段长度的多态性。目前，国外已将AFLP技术广泛的应用于玉米自交系鉴定，国内也有部分学者尝试利用该技术构建玉米自交系的指纹图谱。AFLP技术所需的样品DNA用量少，检测灵敏性强，准确性高，多态性丰富，检测效率高，是玉米纯度鉴定的重要技术。美国先锋公司最早开始利用AFLP技术进行玉米杂交种的鉴定，并用于品种专利保护[11]。但该技术所需仪器设备昂贵、操作程序多、难度大，对DNA纯度和内切酶的质量要求较高，限制了应用范围。

2.4 SSR标记技术

简单序列重复多态性（SSR）又称微卫星DNA，是近年来发展起来的分子标记，由1~6个核苷酸为重复单位组成的重复序列。SSR基本原理是根据特定序列设计成对引物，然后用PCR扩增出长度不同的PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不同个体间的SSR位点多态性[12]。SSR技术多态性丰富，共显性，可以区分纯合与杂合基因型，对DNA数量及质量要求低，试验操作简单，结果重复性好，是目前玉米种子纯度鉴定中较为常用的技术之一。盖树鹏等[13]从30对SSR引物中筛选出6对表现为双亲互补型的引物，建立了6个玉米杂交种纯度鉴定的SSR标记方法。李世聪等[14]从玉米20对SSR核心引物中筛选出8对多态性引物对2个玉米杂交种的纯度进行了有效检测。李晓辉等[15]利用58对引物对21份玉米骨干自交系及其组配的13个杂交种进行了SSR分析，表明SSR标记技术可快速、准确地鉴定玉米杂交种纯度。目前，玉米SSR引物已经实现了信息共享，为SSR标记在玉米种子纯度鉴定方面带来了便利。随着SSR技术研究的深入，应用SSR荧光标记技术可以实现可视化的检测结果读取和自动分析，不需要聚丙烯酰胺凝胶显示PCR结果，实现了一定的高通量检测，提高了玉米种子纯度鉴定效率。

2.5 SNP标记技术

SNP指在不同生物个体DNA序列中单碱基因插入、缺失、颠换、转换等单核苷酸突变带来的DNA序列多态性[16]。随着测序技术的发展，单核苷酸多态性（SNP）作为第三代DNA分子标记技术被广泛应用于玉米种子纯度鉴定。SNP是目前种子纯度鉴定最具发展潜力的标记技术。SNP标记主要具有三个方面的优势：一是在基因组中分布广泛，通常是二等位多态性；二是高通量，易实现自动化分析，实验的分析结果直接由软件读出来，三是试验过程简单，不需要做电泳分析，过程无污染[17]。姚宗泽等[18]等利用SNP技术对玉米品种“家佳荣2号”杂交种子纯度进行检测，证明SNP分子标记中HRM技术鉴定结果可靠，为杂交玉米种子纯度鉴定方法提供了参考。李雪等[19]以11份玉米杂交种及其亲本作为试验材料，分析比较SNP和SSR标记在玉米品种真实性和纯度的鉴定，发现SNP在数据整合共享和位点通量上更加具有技术优势。吴明生等[20]根据玉米多态性SNP位点对种子样品进行检测，准确将混杂其中的亲本鉴定出来，表明了TaqMan-SNP分型技术在鉴定结果的准确度和速度上均优于SSR。因此，SNP标记技术更适合于玉米种子纯度的鉴定。

表3 AFLP分子标记技术

3 前景与展望

分子标记技术可以大大提高玉米杂交种纯度鉴定效率，有效保障玉米种子质量，为实现农业生产安全，促进种业市场规范化、推动农业增产、农民增收贡献了力量。本文综述了五种分子标记技术在玉米杂交种纯度鉴定上的应用，表明SNP作为新一代的分子标记，相比于其它标记技术优势显著，在玉米基因组中多态性分布广泛、标记数量多，易实现全自动化分析。目前，SNP标记被研究者广泛应用，特别是与DNA芯片技术相结合，使试验结果更加准确可靠，技术优势不断显现。随着分子标记技术的不断发展，更多更高效的新型分子标记也将会逐渐涌现，可通过加大力度开发相关玉米DNA指纹图谱，使玉米品种纯度检测技术实现程序化、简单化和自动化，推动玉米种子纯度鉴定研究取得新的成果，以此来服务玉米种业企业建立质量内控体系，帮助玉米种子质量监管部门实现高效监管，最终促进玉米生产、粮食增产和农民增收，在甘肃省乡村振兴战略中提供技术支撑。