豚鼠ESR2基因新的可变剪接体克隆及序列分析

司景磊　李龙　陈秋明　郭晓萍　郭亚芬　蒋钦杨

摘要：【目的】對豚鼠雌激素受体2（ESR2）基因进行克隆及序列分析，并预测分析其编码的蛋白序列，为提高豚鼠产仔性能及其育种打下基础。【方法】根据GenBank已公布的豚鼠ESR2基因序列（登录号XM_003472337）设计引物，以豚鼠卵巢组织总RNA为模板，RT-PCR扩增ESR2基因编码区序列（CDS），利用生物信息学分析其编码蛋白氨基酸的组成及理化性质、二级结构及与相关物种的同源性。【结果】克隆获得的豚鼠ESR2基因CDS长度为1650 bp，编码549个氨基酸，比参照序列（XM_003472337）少54个碱基，是ESR2基因新的可变剪接体，且第7外显子缺失；蛋白质二级结构预测结果表明，豚鼠ESR2成熟肽包含α螺旋、β折叠和无规卷曲3种二级结构元件，由于缺失18个氨基酸导致蛋白质结构发生变异；同源性分析结果显示，豚鼠与长尾龙猫、奥氏更格卢鼠、马、达马拉鼹鼠、裸鼢鼠、鼠狐猴、八齿鼠、猪和人的ESR2基因序列同源性分别为91%、87%、86%、91%、92%、86%、88%、92%和86%。【结论】克隆獲得的豚鼠ESR2基因为新的可变剪接体，可作为研究豚鼠产仔性能及豚鼠育种重要的候选基因之一。

关键词： 豚鼠；产仔性能；ESR2基因；克隆；序列分析

中图分类号： S865.1+1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）05-0731-05

Abstract：【Objective】ESR2 gene of Cavia porcellus was cloned， its sequence was analyzed， and the coded protein structure was predicted and analyzed， in order to provide references for further research on farrowing performance and breeding of C. porcellus. 【Method】According to C. porcellus ESR2 gene sequence（accession no. XM_003472337） published in GenBank， a pair of primers was designed to amplify ESR2 gene coding sequence（CDS） of C. porcellus using RT-PCR. Then the obtained fragments were sequenced and indentified. The physicochemical properties and protein secondary structure of ESR2 was predicted and analyzed using bioinformatics software. 【Result】The CDS of cloned ESR2 gene in C. porcellus was 1650 bp in length， encoding 549 amino acids， and which differed with reference sequence（accession no. XM_003472337） owing to its lack of 54 bases. Therefore， it was speculated that the cloned sequence was a new alternative splicing of ESR2 gene， lacking the 7th exon. In addition， the prediction results of protein secondary structure showed that， C. porcellus ESR2 mature peptide contained three secondary structure elements， which were α helix， β fold， and random coil. ESR2 of C. porcellus shared amino acid sequence homologies of 91%， 87%， 86%， 91%， 92%， 86%， 88%， 92%， 86% with those of Chinchilla lanigera， Dipodomys ordii， Equus caballus， Fukomys damarensis， Homo sapiens， Microcebus murinus， Octodon degus and Sus scrofa， respectively. 【Conclusion】The cloned ESR2 gene of C. porcellus is a new alternative splicing， and can be used as one of candidate genes for further research on farrowing performance and breeding of C. porcellus. C. porcellus has the closest genetic relationship with H. glaber and O. degus， and the farthest genetic relationship with Sus scrofa and Homo sapiens.

Key words： Cavia porcellus； farrowing performance； ESR2 gene； clone； sequence analysis

0 引言

【研究意义】雌激素受体（Estrogen receptor，ESR）是类固醇受体超家族的主要成员之一，具有调控转录蛋白的重要功能，对雌激素基因的调控和表达具有重要作用，是最早被发现并用于调控动物繁殖性状的候选基因（胡建伟等，2014）。通过ESR介导，雌激素刺激雌性动物的性腺，引起第二性征发育及繁殖周期的变化，维持其生殖力，且在妊娠时可刺激垂体分泌和释放黄体生成素（Luteinizing hormone，LH），即ESR与雌激素的生物学作用密切相关（陈克飞等，2000；Findlay et al.，2000；毛永江和丁家桐，2003）。通过分析豚鼠ESR基因序列，有助于深入研究ESR基因对其产仔数的影响，揭示其分子调节机制，对有效提高豚鼠的繁殖性状具有重要意义。【前人研究进展】目前，已有较多关于ESR基因的研究报道。Jenson和Jacobson于1962年在阴道和子宫等靶组织中首次发现ESR基因（王怀禹，2010）；Walter等（1985）研究发现，人类的ESR2基因在许多组织中均有表达，其中以子宫、卵巢等组织中的表达量较高，其前体蛋白含530个氨基酸，在结构上可分为6个结构区，在功能上可分为4个结构域；Green等（1986）、Enmark等（1998）研究发现，人类的ESR基因位于第6染色体，其cDNA阅读框架包含1788个核苷酸，编码595个氨基酸，约跨越140 kb的区域；Kumar等（1986）、Leung等（2006）研究表明，ESR2的不同功能结构域呈现不同生理作用，其中第三结构域为DNA结合结构域，第五和第六结构域为激素结合结构域，这些功能结构域会引起受体蛋白构象的改变，从而调控靶基因转录；Kuiper等（1996）将哺乳动物ESR基因分为ESR1和ESR2两种亚型，并由不同基因编码；Rothschild等（1996）研究证实，ESR基因是影响猪产仔数的主效基因或是与影响猪产仔数主效基因紧密的连锁标记；邓小华等（2001）研究发现，雌性大鼠的大脑及下丘脑视前区均有雌激素受体神经元分布，且ESR基因主要分布于梨形核、下丘脑内视前区、弓状核等器官；段炼等（2011）研究发现ESR是影响猪产仔數的主效基因。【本研究切入点】由于豚鼠对药物及细菌等病原菌较敏感，且个体较小、性情温顺，是理想的实验动物模型，但豚鼠的窝产仔数少（2～3只）、妊娠期长（62～72 d），远不能满足实验需求，而且目前国内鲜见有关ESR2基因对豚鼠产仔性状影响的研究报道。【拟解决的关键问题】对豚鼠ESR2基因进行克隆及序列分析，并预测和分析其编码的蛋白质，为后期开展ESR2基因表达对豚鼠繁殖性状的影响打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

雌性豚鼠由广西大学动物科学技术学院动物遗传与育种实验室提供，发育正常、性成熟且无重病史，无菌采集其卵巢组织样品，置于-80 ℃下保存备用。Trizol试剂、DNA胶回收纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；酵母浸出物、胰蛋白胨购自英国OXOID公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞由广西大学动物科学技术学院动物遗传育种实验室保存；pMD18-T载体购自TaKaRa公司；Taq DNA合成酶购自广州东盛生物科技有限公司。

1. 2 引物设计与合成

根据GenBank已公布的豚鼠ESR2基因序列（登录号XM_003472337），采用Oligo 7.0软件设计特异性的引物（P1：5'-ATGTCTCTTTGTGCCCCTT-3'；P2：5'-CC

ATAGATAAGAACCGGCG-3'），目的片段为1650 bp。引物由深圳华大基因科技有限公司合成。

1. 3 总RNA提取

采用Trizol法提取豚鼠卵巢组织总RNA，利用核酸仪检测总RNA的纯度和浓度，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。

1. 4 目的片段克隆

RT-PCR反应体系25.0 μL：PrimeScriptTM 1 Step Enzyme Mix l.0 μL，2×1 Step Buffer 12.5 μL，RNA模板2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，Rnase Free dH2O补足至25.0 μL。扩增程序：50 ℃反转录30 min；94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，58.5 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，进行27个循环；72 ℃终延伸90 s。

1. 5 阳性克隆验证

将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，按照胶回收纯化试剂盒说明回收目的片段，将目的基因连接至pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LA培养基上，于37 ℃培养箱中倒置培养过夜。10 h后挑取转化子进行菌液PCR验证，将阳性转化子送至深圳华大基因科技有限公司进行测序。

1. 6 序列分析和生物信息学分析

应用Lasergene 7.0对测序结果进行序列比对，以MEGA 6.0对其进行同源性分析，同时利用ExPASy数据库中的ProtParam预测ESR2基因编码蛋白的氨基酸组成和理化性质。

2 结果与分析

2. 1 總RNA提取结果

豚鼠卵巢组织总RNA的电泳结果如图1所示，28S、18S和5S条带清晰可见，表明提取的总RNA质量较好，可用于后续的基因克隆。

2. 2 ESR2基因扩增结果

通过RT-PCR扩增ESR2基因，电泳结果如图2所示，单一的条带清晰可见，约1600 bp，大小与预期结果相符。

2. 3 阳性克隆的验证结果

将PCR产物纯化回收后连接至pMD18-T载体，将重组载体转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子进行菌液PCR验证，扩增的基因片段约1600 bp（图3），与预期结果相符，表明所挑选转化子为阳性。

2. 4 序列分析结果

利用DNASTAR生物軟件中的MegAlign对测序结果进行分析，结果表明，克隆获得的ESR2基因CDS全长1650 bp，与GenBank已公布的豚鼠ESR2基因序列（登录号XM_003472337）相比，在1150～1203位点缺失54个碱基，其他位点未发生突变（图4）。开放阅读框分析结果表明，克隆获得的ESR2基因编码549个氨基酸（图5），与参考序列（XM_003472337）的氨基酸序列相比缺失18个氨基酸。因此，推测克隆获得的ESR2基因可能为新的可变剪接体。豚鼠ESR2基因应有11个外显子，所获得的新可变剪接体为第7个外显子缺失。

2. 5 蛋白质结构分析结果

利用ExPASy数据库中的ProtParam预测ESR2基因编码蛋白的氨基酸组成和理化性质，发现其含549个氨基酸，包含20种常用的氨基酸，其中丝氨酸（12.2%）、亮氨酸（11.84%）和甘氨酸（8.5%）含量较多，精氨酸（5.28%）、色氨酸（1.28）和组氨酸（3.64%）含量较少，且以色氨酸含量最少。利用Protein Model Portal（PMP）软件预测豚鼠ESR蛋白二级结构，该可变剪接体蛋白92处附近残基疏水性较强（分值为2.067），379处附近残基的亲水性较强（分值为0.289）。成熟肽包含有α-螺旋、β-折叠和无规卷曲3种二级结构元件，结果如图6所示，该可变剪接体为第7外显子缺失，缺失18个氨基酸导致蛋白质结构发生变异。

2. 6 ESR2基因同源性分析及系统进化树构建

将克隆获得的豚鼠ESR2基因序列与其他物种进行同源比对并建立物种系统进化树（图7），结果显示，豚鼠与长尾龙猫（Chinchilla lanigera，XM_005399138）、奥氏更格卢鼠（Dipodomys ordii，XM_013014401）、马（Equus caballus， NM_001309479）、达马拉鼹鼠（Fu-

komys damarensis， XM_010603004）、裸鼢鼠（Heterocephalus glaber， XM_004837415）、人（Homo sapiens AB006590）、鼠狐猴（Microcebus murinus， XR_001157

315）、八齿鼠（Octodon degus， XM_004624792）、猪（Sus scrofa， AF267736.1）的同源性分别为91%、87%、86%、91%、92%、86%、88%、92%和86%。其中，与豚鼠遗传距离最近的是裸鼢鼠和八齿鼠，最远的是人类和猪，符合进化规律。

3 讨论

真核生物中几乎每个基因含有多个内含子和外显子，经转录生成mRNA前体，通过不同的剪接方式形成不同剪接异构体，称为可变剪接体（Stamm et al.，2005）。可变剪接体的存在使真核生物蛋白质具有多样性。可变剪接体是一个古老的进化过程，且可能出现在真核生物共同的祖先中，单个外显子的功能是通过进化选择来确定（Irimia et al.，2007；Keren et al.，2010）。在进化选择的过程中，具重要功能的外显子被保存下来，而无功能的外显子被删除或替代（Magen and Ast，2005；Xing and Lee，2005）。ESR是配体激活转录因子家族中的一种核酸受体，调控雌性脊椎动物组织中雌激素基因的表达（狄冉等，2008），自Baltimoer于1980年在小鼠的IgM基因中发现第一个可变剪接体的产生模型（党万太等，2013）以来，大量研究表明，ESR1和ESR2基因也存在可变剪接体（Wimberly et al.，2014）。虽然目前还不能确定这些可变剪接体存在的生物学意义，但可确定其对ESR基因的表达具有一定的调控作用。在人类的ESR2基因中发现10种缺失不同外显子组合的mRNA可变剪接体（Poola et al.，2002），且对乳腺癌细胞增殖具有重要的生物学作用（Sotoca et al.，2012）。关于ESR基因与产仔数相关的研究多见于猪上，在豚鼠上鲜见报道，本研究对豚鼠ESR2基因进行克隆及序列分析，填补了豚鼠繁殖性能相关基因研究在国内的空白。结果显示，豚鼠ESR2基因CDS全长为1650 bp，编码549个氨基酸，与GenBank已公布的豚鼠ESR2基因序列相比，无碱基突变，具有高度的保守性，但缺失了54个碱基，表明成功克隆了豚鼠ESR2基因，且所克隆的ESR2基因可能为一种新的可变剪接体。这与王怀禹（2010）研究发现猪的ESR2基因位于14q22-q24，且编码530个氨基酸的结果存在差异，其原因可能为不同物种间的差异所造成。然而，该基因碱基缺失是否产生新的功能及其功能对豚鼠造成的影响还需进一步研究。

大量研究证实，ESR2基因在动物体的卵巢和睾丸组织中有较高的表达（Nilsson et al.，2001），对调控猪和小鼠的产仔性能具有重要作用。Rothschild等（1996）通过候选基因法对含有50%中国梅山猪血缘合成系进行研究，发现ESR基因与產仔数主效基因紧密连锁；Couse等（2001）将小鼠的ESR2基因敲除后，小鼠产仔数明显下降，且幼仔的个体较小；丁家桐等（2002）对猪ESR基因的PvuⅡ多态位点与繁殖性能的相关性开展研究，结果表明，ESR基因型与总产仔数和产活仔数呈极显著相关性。据此推测，豚鼠的窝产仔数少且妊娠期长的主要原因是ESR2对雌激素基因的调控和表达所致，应深入研究ESR2基因转录表达对雌激素对豚鼠繁殖力调控的分子机制，为提高豚鼠产仔性能奠定理论基础。

4 结论

本研究克隆获得的豚鼠ESR2基因为新的可变剪接体，可作为研究豚鼠产仔性能及豚鼠育种重要的候选基因之一。

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（責任編辑 陈 燕）