双价抗虫转基因水稻的育成及初步鉴定

崔彦芹 李尚伟 张丽萍 罗洪发 李云峰 查仁明

摘要：【目的】构建双价抗虫基因表达载体并转化水稻，为选育广谱、高抗转基因抗虫水稻提供技术参考。【方法】构建半夏凝集素基因（pta）和苏云金杆芽孢菌基因（Bt）两个抗虫基因的双价表达载体pCAMBIA1301-Bt-pta，利用大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌LBA4404转化水稻恢复系辐恢838，同时对转化植株进行GUS染色及PCR鉴定。【结果】以构建的双价植物表达载体pCAMBIA1301-Bt-pta为模板，PCR扩增到pta基因的部分片段，大小为807 bp，且该载体经Hind Ⅲ酶切后，能得到15854 bp的中间载体pCAMBIA1301-Bt片段和2046 bp的pta基因片段。对转化植株进行GUS染色，得到3株转基因阳性植株，经PCR鉴定结果显示外源基因已成功导入水稻。【结论】通过构建双价抗虫基因表达载体并转化水稻，成功获得的转基因植株可用于水稻抗虫转基因恢复系及组合的研究，以提高其抗病虫害能力。

关键词： Bt基因；pta基因；载体构建；转基因水稻；鉴定

中图分类号： S511.035.3 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）02-0169-05

0 引言

【研究意义】水稻是最重要的粮食作物之一，世界上半数以上的人口以水稻为主食。虫害是造成水稻减产的主要原因，据报道，田间水稻害虫种类在624种以上，每年因螟虫造成的产量损失达1.0×1010 t，对其品质也造成严重威胁（刘立军等，2009；朱祯，2010；张岚等，2011），因此选育抗虫水稻品种尤为重要，但仅靠常规育种难以解决抗虫育种资源稀缺的问题，须通过研究转基因水稻来完成。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）基因的表达产物为Bt毒蛋白，是一种杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal protein，ICP），其杀虫效果安全、高效，对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等昆虫具有高度特异性（孟志刚，2012）。半夏凝集素（Pinellia ternate agglutinin，pta）对同翅目害虫如稻飞虱、叶蝉等有显著抗虫作用，故pta基因常作为外源基因应用于转基因抗虫作物研究（赵欢和彭正松，2014）。在抗虫育种时，若能将两个基因同时导入作物中，便可避免抗性基因的单一性和脆弱性，维持作物抗虫的持久性。【前人研究进展】近年来，随着植物基因工程的快速发展，通过转基因技术将外源基因导入植物，使其自身携带抗虫能力以达到抗虫目的（韩兰芝等，2006）。熊恒硕等（2008）将含有CryIA（a）/CryIA（c）、pta和Bar基因的双价植物表达载体p3300-Bt-pta转化苜蓿子叶，成功获得阳性转化植株。田强强等（2011）构建的双价抗病虫基因植物表达载体Lc-ChiA-pBI121可用于植物转基因研究，提高植物抗病虫害能力。Xiao等（2012）将pta和Cry1Ac基因同时导入大青，发现其协同作用可使植株对飞蛾和蚜虫的抗性增强。张学明等（2015）用植物表达载体pC1301-LoxRi和pCAMBIA3301-KTi-SBA，构建双价表达载体pCAMBIA3301-SBA-Lox并转化大豆，获得转基因大豆。【本研究切入点】鳞翅目和同翅目是危害水稻较严重的昆虫种类，Bt和pta基因分别对这两类昆虫有显著抗虫作用，但目前尚无将Bt和pta基因同时导入水稻而获得广谱性抗虫水稻的研究报道。【拟解决的关键问题】构建双价植物表达载体pCAMBIA1301-Bt-pta，转化水稻恢复系辐恢838，以期获得广谱性抗虫水稻，为获得高抗、广谱抗虫水稻材料提供基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

受体材料为水稻优良恢复系辐恢838，由贵州大学农学院提供；大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌LBA4404由西南大学水稻研究所提供。双酶切载体pCAMBIA1301和质粒pUC57-Bt和pCU57-pta由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。BamH I、Spe I等限制性内切酶、T4 DNA连接酶、GUS染液、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒及其他重要试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要仪器设备：琼脂糖电泳仪（美国BIO-RAD公司）、UVP凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）、微量移液器（德国Eppendorf公司）等。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 表达载体构建 用BamH I和Spe I双酶切载体pCAMBIA1301和质粒pUC57-Bt，再用T4 DNA连接酶将两者连接可获得中间载体pCAMBIA1301-Bt，最后用Hind Ⅲ酶切质粒pCU57-pta和中间载体，并连接构建双价植物表达载体pCAMBIA1301-Bt-pta。

1. 2. 2 载体转化及鉴定 用热激法将构建的载体转化大肠杆菌DH5α，经抗生素筛选、PCR鉴定（引物见表1，反应体系见表2，扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，进行35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存备用）、Hind Ⅲ酶切鉴定和测序，获得阳性克隆子。再用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒，用冻融法将其转化根癌农杆菌LBA4404，对农杆菌进行PCR和酶切鉴定，操作方法与大肠杆菌同（Sambrook and David，2002）。

1. 2. 3 含Bt-pta基因的农杆菌转化水稻 将含Bt-pta的根癌农杆菌LBA4404送至武汉泊远生物科技有限公司，经水稻成熟胚预处理、农杆菌侵染、筛选Ⅰ、筛選Ⅱ、分化、生根及分子检测等，以获得Bt-pta双价抗虫转基因水稻。

1. 2. 4 GUS组织化学染色 将转基因水稻植株的嫩叶剪切后放于0.2 mL PCR管中，加入适量GUS染液，37 ℃下染色3～20 h，至蓝色清晰可见。

1. 2. 5 PCR檢测 根据pta、GUS及Bt基因序列设计引物（表1）。PCR反应体系（25.00 μL）：DNA模板 2.00 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，10 mmol/L dNTPs 0.50 μL，引物F1和R1各1.50 μL，Taq DNA polymerase 0.25 μL，加灭菌水至25.00 μL。扩增程序：94 ℃预变性30 s；94 ℃ 30 s，59～60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

2 结果与分析

2. 1 表达载体的构建及鉴定结果

构建的植物表达载体pCAMBIA1301-Bt-pta如图1所示。表达载体转化大肠杆菌DH5α后，经含抗生素培养基筛选，挑取大肠杆菌菌落进行PCR鉴定，结果见图2，扩增产物大小约807 bp，与预期结果相符，可初步鉴定为阳性克隆。提取阳性大肠杆菌质粒，经Hind Ⅲ酶切后（图3），得到15854 bp的中间载体pCAMBIA1301-Bt片段和2046 bp的pta基因片段（已插入酶切位点），表明目的基因pta已连接至中间载体pCAMBIA1301-Bt上，成功构建双价植物表达载体pCAMBIA1301-Bt-pta。

2. 2 转基因阳性植株的鉴定结果

转化再生水稻植株经驯化、移栽后，共获得15株转化植株，取其幼嫩叶片剪碎后进行GUS染色，结果如图4所示，其中3株为转基因阳性植株。对3株阳性植株的pta、Bt及GUS基因分别进行PCR检测，结果如图5和图6所示。Bt基因检测结果表明，除阴性对照未扩增出目的片段外，阳性对照（阳性质粒）及GUS染色呈阳性的3株转基因植株检测结果均与预期结果（396 bp）相符；pta基因检测结果表明，阳性对照（阳性质粒）及GUS染色呈阳性的3株转基因植株检测结果均与预期结果（314 bp）相符；GUS基因检测结果表明，除阴性对照未扩增出目的片段外，阳性对照（阳性质粒）及GUS染色呈阳性的3株转基因植株检测结果也与预期结果（350 bp）相符。

3 讨论

目前单价转基因技术逐渐成熟，已广泛应用于农作育种的研究领域。Datta等（1998）将Cry1Ab基因导入各种籼稻和粳稻中，获得一系列对三化螟幼虫具有高致死率的转Bt基因水稻；张红宇等（2003）首次成功将从半夏花序中克隆的半夏凝集素基因导入3个水稻品种，为pta基因在水稻抗虫上的应用奠定基础；戴军等（2014）将Bt cry1Ah基因导入玉米自交系综31中，获得1株对玉米螟有显著抗性的转基因植株。随着转基因抗虫育种研究的深入，存在的问题日益凸显，如转单价抗虫基因植株抗虫谱单一，害虫易产生抗性等。因此，近年国内外的转基因研究呈现由单一基因向多基因发展的趋势（余桂容等，2015）。随着技术的不断成熟，可成功构建双价表达载体并转化小麦、烟草等作物中，培育出多种双价转基因植株，如范媛媛等（2004）构建了植物表达载体p3300-Bt-pta并转化烟草，获得转基因抗虫烟草；Yu和Wei（2008）将Bt和pta基因转化小麦，并获得双价抗虫转基因小麦。

本研究通过构建双价抗虫基因表达载体pCAMBIA1301-Bt-pta并转化水稻，由于该植物表达载体是以GUS基因为报告基因，可通过检测报告基因的表达产物来快速筛选转基因阳性植株。但在将转基因水稻从人工气候箱移栽到海南三亚大田过程中，由于环境变化和长时间运输导致大量禾苗死亡，只得到3株阳性转基因植株，由于其数量较少，为确保数据的准确性，未对其进行农艺形状分析。此外，本研究仅对T0代转基因植株进行初步的筛选和鉴定，根据孟德尔遗传定律，基因在后代会产生分离，为得到纯合和稳定遗传的植株，需进一步对转基因植株的后代进行分子检测如Southern blotting、Western blotting等及连续多代自交筛选和鉴定，将出现性状分离的植株淘汰，筛选出高代纯合转基因植株，并对转基因后代纯系进行株高、产量及相关性状考察及抗虫性鉴定。

4 结论

本研究筛选出3株Bt-pta双价转基因水稻，可用于水稻抗虫转基因恢复系及组合的研究，以提高其抗病虫害能力。

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（责任编辑 陈 燕）