橡胶树乳管表达HbHMGR1基因双元表达载体构建与鉴定

贺永国 李哲 黄绵佳 曾宪海 林位夫 刘洁琼 张春红 马晓晓

摘要：【目的】克隆橡胶树乳管特异性强启动子HEV2.1（PHEV2.1），构建天然橡胶生物合成途径关键限速酶基因（HbHMGR1）的乳管特异性植物表达载体，为橡胶树遗传转化奠定基础。【方法】根据已报道的HEV2.1序列（GenBank登录号AY247789.1）设计1对特异引物，采用PCR从橡胶树热研7-33-97基因组DNA中克隆PHEV2.1，与HbHMGR1基因融合构建橡胶树乳管特异性植物表达载体，并以PCR和限制性内切酶酶切进行鉴定。【结果】用特异引物可从热研7-33-97基因组DNA中扩增获得1852 bp的PHEV2.1片段，其与AY247789.1启动子序列的同源性为98.6%。将PHEV2.1与HbHMGR1基因融合构建乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，经PCR和限制性内切酶酶切鉴定证明植物表达载体构建成功。【结论】将PHEV2.1和HbHMGR1基因先构建到pCAMBIA3301载体上再克隆至pCAMBIA2301载体上，能有效解决直接克隆至pCAMBIA2301载体上出现Pst I突变、阻碍载体构建的难题，成功构建获得乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1。

关键词： 橡胶树；乳管特异性启动子PHEV2.1；HbHMGR1基因；植物表达载体；构建；鉴定

中图分类号： S794.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）02-0163-06

0 引言

【研究意义】转录水平调控是基因表达调控的主要环节，对植物启动子功能进行研究不仅可以揭示相应基因的表达模式，还能为利用植物基因工程技术实现基因的高效特异性表达提供有效途径。橡胶蛋白（Hevein）是胶乳的主要成分，可在乳管中高效表达，占可溶性蛋白质的50%～70%，其基因家族成员HEV2.1基因启动子是乳管特异表达的强启动子（Van Parijs et al.，1991；Montoro et al.，2008）。橡胶树3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶1（HbHMGR1）是橡胶生物合成途径的关键限速酶（Lynen，1969；Chye et al.，1992；马晓晓等，2014），因此利用HEV2.1基因启动子和HbHMGR1基因构建乳管特异性表达载体以转化橡胶树，对提高橡胶树的产量具有重要意义。【前人研究进展】早在20世纪60年代橡胶蛋白就已被认识（Archer，1960），但在随后的40年间除Broekaert等（1990）成功克隆获得过一个编码橡胶蛋白的cDNA序列（GenBank登录号M36986）外，有关编码橡胶蛋白基因及启动子的研究鲜有报道。2005年，Pujade-Renaud等利用文库筛选法从橡胶树基因组DNA中分离获得5个编码橡胶蛋白的基因，首次证明橡胶蛋白是由一个小基因家族所编码；同时克隆获得HEV1.1启动子（PHEV1.1）和HEV2.1启动子（PHEV2.1），并融合uidA基因转化水稻，结果发现这两个启动子均能在转基因水稻中驱动uidA基因的表达，且以PHEV2.1的功能最强，能驱动uidA基因在转基因水稻的许多组织中高水平表达。Montoro等（2008）利用PHEV2.1融合uidA基因，并转化橡胶树分析其表达特性，结果表明，PHEV2.1驱动uidA基因在根、茎、叶的乳管中特异性强表达，印证了Archer等（1969）关于橡胶蛋白在乳管细胞中特异性表达的观点；随后还发现PHEV2.1可受光诱导，驱动uidA基因在叶片所有细胞类型中表达。【本研究切入点】目前尚无利用PHEV2.1构建HbHMGR1乳管特异性表达载体的研究报道。【拟解决的关键问题】通过提取橡胶树高产品种叶片基因组DNA，克隆橡胶树乳管特异性启动子PHEV2.1，用其构建乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，以期为下一步橡胶树遗传转化奠定基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

橡胶树优良品种热研7-33-97的幼嫩叶片采自中国热带农业科学院橡胶研究所橡胶树国家种质圃，用于提取基因组DNA。植物表达载体pCAMBIA2301-MCS（T-DNA：35S poly A-NPTII-35S promoter-NOS terminator-MCS-35S promoter-uidA-NOS Poly A）与HbHMGR1基因由农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室提供；pCAMBIA3301载体由海南大学毕政鸿惠赠；大肠杆菌Trans5α購自北京全式金生物技术有限公司；克隆载体pMD19-T、高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker、T4 DNA连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司；胶回收试剂盒、质粒提取及纯化试剂盒购自美国Omega公司；限制性内切酶Hind III、Pst I和Xma I购自美国NEB公司；其他试剂均为国产分析纯。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 橡胶树叶片基因组DNA提取 橡胶树叶片基因组DNA提取参照钟淦彬等（2010）和邹智等（2014）的方法进行小量提取。

1. 2. 2 橡胶树乳管特异性启动子PHEV2.1克隆 根据Pujade-Renaud等（2005）报道的HEV2.1序列（NCBI登录号AY247789）截取起始密码子前的1830 bp碱基序列，用Primer 5.0设计1对特异性引物PHF1（5'-CCC

因组DNA为模板，以PHF1和PHR1为引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、回收、加尾“A”后，克隆至pMD19-T载体上，转化大肠杆菌Trans5α，经12～16 h的培养后挑取单菌落进行PCR检测，选取PCR检测呈阳性的菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果用NCBI网上的BLASTn工具进行序列同源性分析。

1. 2. 3 HbHMGR1乳管特异性植物表达载体构建及酶切鉴定 分别以Xba I和Xma I对pCAMBIA3301和pCAMBIA2301-HbHMGR1进行双酶切，酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收pCAMBIA3301的大片段和pCAMBIA2301-HbHMGR1的小片段，将两片段用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌Trans5α，过夜培养后挑取单菌落进行PCR检测，提取阳性重组质粒pCAMBIA3301-HbHMGR1；再用Hind III和Pst I分别对pCAMBIA3301-HbHMGR1和pMD19-T-PHEV2.1进行双酶切，电泳结束后对pCAMBIA3301-HbHMGR1的大片段和pMD19-T-PHEV2.1的小片段进行切胶回收，回收产物用T4 DNA连接酶连接过夜，转化大肠杆菌Trans5α，过夜培养后挑取单菌落进行PCR检测，提取阳性重组质粒，并用Hind III、Pst I和Xma I对其进行酶切鉴定，确认是否得到阳性重组质粒为pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1；最后用Hind III和Xma I将PHEV2.1-HbHMGR1重组片段从pCAMBIA3301- PHEV2.1-HbHMGR1上切下，将其连接到pCAMBIA2301-MCS的Hind III和Xma I间，获得植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，转化大肠杆菌Trans5α，挑取单菌落进行菌落PCR，提取阳性重组质粒，用Hind III和Xma I进行酶切鉴定，确认HbHMGR1乳管特异性植物表达载体构建是否成功。

2 结果与分析

2. 1 橡胶树叶片基因组DNA的提取结果

从橡胶树热研7-33-97的叶片中小量提取基因组DNA，取2.0 μL稀释5倍后进行琼脂糖凝胶电泳，检测其纯度。由图1可以看出，提取获得的橡胶树叶片基因组DNA条带整齐、清晰、完整性好、无明显的杂质和降解现象。利用微型紫外分光光度计测定，其浓度约100 ng/μL。

2. 2 橡胶树乳管特异性启动子PHEV2.1的克隆及序列分析结果

以橡胶树热研7-33-97的叶片基因组DNA为模板，用特异性引物PHF1和PHR1进行PCR扩增，获得一条近2000 bp左右的条带。经生工生物工程（上海）股份有限公司测序结果证实，从热研7-33-97基因组中扩增获得的PHEV2.1为1852 bp。将所获得的序列录入NCBI的BLASTn数据库（http：//blast.Ncbi.Nlm.Nih.gov/ Blast.cgi？ PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BLastSea-

rch&LINK_LOC=blasthome）与Pujade-Renaud等（2005）报道的PHEV2.1序列（GenBank登录号AY247789.1）进行同源性比对分析，结果显示，克隆获得的PHEV2.1启动子序列与AY247789.1启动子序列的同源性为98.6%，相对于AY247789.1启动子序列（以此碱基序号为准），其差异主要表现为：164G突变为T，475T和476T间多了一个AT， 582T突变为A，591T和592T间多了一段CACA

TATTTTGCCTCTGTT序列，845C突变为T，874A和875T间多了一个A。

2. 3 植物表达载体的酶切鉴定结果

分别采用Hind III、Pst I、Xma I和Hind III、Xma I对pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1进行酶切，其中，三酶切获得一条与双酶切等同的大片段和一条近2000 bp的条带，近2000 bp的条带为大小相近的PHEV2.1片段（1852 bp）和HbHMGR1片段（1728 bp），两者由于大小相近而重叠显示为一条条带。此外，双酶切获得的小片段介于3000～5000 bp，与3592 bp的PHEV2.1-HbHMGR1重组片段大小一致。再以PHEV2.1的上游引物PHHF和HbHMGR1的下游引物PHHR对pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1进行PCR扩增，也获得一条介于3000～5000 bp的条带，与双酶切获得的小片段一致，说明中间植物表达载体pCAMBIA3301-PHEV2.1-HbHMGR1已构建成功。

提取质粒pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，以pCAMBIA2301-MCS为阴性对照、pCAMBIA3301- PHEV2.1-HbHMGR1为阳性对照，分别采用Hind III和Xma I對其进行双酶切，结果表明，pCAMBIA2301- PHEV2.1-HbHMGR1经双酶切后得到一条与阳性对照小片段等同且介于3000～5000 bp的小片段和一条在10000 bp以上的大片段，小片段与PHEV2.1-

3 讨论

由于生物具有遗传多样性，即使是同一物种不同品种间的基因组DNA在遗传组成上也存在差异，从不同品种基因组中克隆获得的同源启动子也时有差异。鲁旭（2014）在研究橡胶树HbFCA功能时，用DNAMAN软件对比了克隆自热研7-33-97、边沁橡胶、少花橡胶、光亮橡胶、光亮矮生橡胶、2131野生种、色宝橡胶、热研幼花和热研预测等9个橡胶树品种的HbFCA启动子，结果发现9个品种的HbFCA启动子同源性为98.77%，其中热研幼花与热研预测的相似性达99.95%。这种现象同样存在于单子叶植物中，萧凤回（2008）通过分析大麦、水稻干旱可诱导基因LEA启动子，发现克隆自不同品种的同源启动子序列间均存在一定差异。本研究根据Pujade-Renaud等（2005）报道的PHEV2.1序列（GenBank登录号AY247789.1）设计引物，以橡胶树热研7-33-97的基因组DNA为模板，多次PCR扩增均获得一段1852 bp的序列，经BLASTn比对分析证实，多次克隆获得的序列均相同，但与Pujade-Renaud等（2005）克隆自橡胶树品种RRIM600的PHEV2.1序列略有差异，同源性为98.6%。

HbHMGR1是橡胶生物合成途径的关键限速酶（Lynen，1969；Chye et al.，1992；马晓晓等，2014），其基因在乳管中特异性表达（Chye et al.，1991）。因此，提高HbHMGR1基因在橡胶树乳管中的表达量，对促进橡胶的生物合成及提高其产量具有重要意义。原始的植物表达载体pCAMBIA2301理论上只有唯一的1个Pst I限制性酶切位点，但实际应用中的pCAMBIA2301载体上常存在2个突变增加的Pst I酶切位点。为此，本研究将PHEV2.1和HbHMGR1基因先构建到pCAMBIA3301载体上，经双酶切后再克隆至pCAMBIA2301载体上，能有效解决直接克隆至pCAMBIA2301上出现Pst I突变、阻碍载体构建的难题，成功构建获得乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-

PHEV2.1-HbHMGR1。该研究结果为进一步利用乳管特异性表达载体转化橡胶树及研究HbHMGR1基因在乳管中表达促进胶乳生物合成的机理奠定了基础。

4 结论

将PHEV2.1和HbHMGR1基因先构建到pCAMBIA3301载体上再克隆至pCAMBIA2301载体上，能有效解决直接克隆至pCAMBIA2301载体上出现Pst I突变、阻碍载体构建的难题，成功构建获得乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1。

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（責任编辑 兰宗宝）