黏菌素耐药基因mcr—1 TaqMan—MGB荧光定量PCR检测方法的建立

施开创 尹彦文 温丽霞 屈素洁 王海清 胡杰

摘要：【目的】建立针对黏菌素耐药基因mcr-1的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法，为监控mcr-1基因携带细菌提供技术支持。【方法】针对mcr-1基因保守序列设计特异性引物和MGB探针，构建重组质粒作为阳性标准品，优化引物、探针浓度及Rox参比染料用量、退火温度等反应条件，建立针对mcr-1基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法，并通过特异性、敏感性、重复性试验及临床应用验证其实用性。【结果】TaqMan-MGB荧光定量PCR最佳反应体系20.00 ?L：Premix Ex TaqTM 10.00 μL，Rox参比染料（50×）0.25 ?L，引物MCR-1F/MCR-1R（10 ?mol/L）各0.50 ?L，MCR-1-P探针（10 ?mol/L）0.50 ?L，重组质粒pMCR-1（模板）2.00 μL，灭菌双蒸水6.25 ?L。扩增程序：95 ℃预变性20 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，进行40个循环。该检测方法能特异性扩增出mcr-1基因，其检测敏感性为2.85拷贝/?L，是常规PCR的100倍，组内和组间重复性试验的变异系数为0.37%～1.18%，均小于1.20%。采用建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR对82株广西鸡源致病性沙门氏菌分离株进行检测，结果未发现有携带mcr-1基因的菌株。【结论】针对mcr-1基因建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点，可用于临床筛查mcr-1基因，为监控mcr-1基因携带细菌提供技术支持。

关键词： 黏菌素；mcr-1基因；TaqMan-MGB探针；荧光定量PCR

中图分类号： S854.44 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1447-06

0 引言

【研究意义】当前，细菌的耐药性问题日益严重，给临床医学、兽医临床学及食品安全等领域带来严峻挑战（黎宗强等，2016；毛福超等，2016；王影等，2017；田亚凯，2018）。多黏菌素类抗生素因具有促进畜禽生长、抗菌作用等显著优势，在养殖业中长期被世界各国作为饲料添加劑或治疗药物广泛应用（Kempf et al.，2016；王影等，2017），由于细菌对黏菌素类抗生素的耐药率一直较低，导致其耐药性问题极易被忽视。随着携带质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1及耐多黏菌素细菌被发现，并证实mcr-1基因可通过结合性质粒在不同菌种间传播，介导低水平的黏菌素耐药（易灵娴等，2017），说明其危害日趋严重，因此加强对携带质粒介导黏菌素耐药基因细菌的监测和防控迫在眉睫。【前人研究进展】2016年，我国科学家首次在来自养殖场的黏菌素耐药大肠杆菌分离株中发现可水平转移的mcr-1基因（Liu et al.，2016），并证实mcr-1蛋白具有磷酸乙醇胺转移酶活性，可催化磷酸乙醇胺与脂多糖表面类脂A结合，介导黏菌素耐药。此后，在丹麦、泰国、尼日利亚、法国、英国、加拿大、美国、德国、突尼斯、日本、越南等国家也相继发现mcr-1基因（Irrgang et al.，2016；McGann et al.，2016；王秀娜等，2017；易灵娴等，2017）。至今，我国已从多个省（区、市）的人类或动物临床样品及环境样品的细菌分离株中检测到mcr-1基因，包括从动物排泄物、环境样品（食品、水和蔬菜）、临床样品及健康群体（婴儿）中分离获得的多种肠杆菌科细菌[大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）等]及其他细菌[肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、索氏志贺菌（Shigella sonnei）等]（Zurfuh et al.，2016；Cui et al.，2017；Huang et al.，2017；王秀娜等，2017；易灵娴等，2017）。【本研究切入点】多黏菌素被认为是细菌耐药的最后一道防线，mcr-1基因广泛且快速的传播引发了全球性关注，因此急需建立针对mcr-1基因的快速检测方法，用于监测临床流行菌株携带mcr-1基因的情况。【拟解决的关键问题】建立针对mcr-1基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法，为监控mcr-1基因携带细菌提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

鸡白痢沙门氏菌（S. pullorum）（CVCC538）、鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）（ATCC14028）、大肠杆菌（ATCC25922）和多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）（CVCC386）的质控标准株购自中国兽医微生物保藏中心。82株鸡源致病性沙门氏菌由广西动物疫病预防控制中心于2013～2017年分离获得，其药敏试验结果表明均为多重耐药菌株（黎宗强等，2016）。Premix Ex TaqTM试剂盒、pMD18-T载体、细菌基因组抽提试剂盒、质粒DNA抽提试剂盒、mcr-1基因引物及MGB探针（表1）等均购自TaKaRa公司。

1. 2 重组质粒标准品构建

根据mcr-1基因序列，体外合成保守区域309 bp的单链DNA片段，经PCR扩增该片段后克隆至pMD18-T载体上，即获得携带mcr-1基因309 bp片段的阳性质粒。以此为模板，利用引物对（MCR-1F/MCR-1R）进行扩增并将扩增产物克隆至pMD18-T载体上，获得重组质粒pMCR-1，鉴定正确后作为阳性标准品。

1. 3 反应条件确定和标准曲线绘制

以重组质粒pMCR-1为模板，建立20.00 ?L的TaqMan-MGB荧光定量PCR反应体系，并采用方阵法对引物浓度（0.1～0.6 pmol/?L）、探针浓度（0.2～0.8 pmol/?L）、50倍稀释后的Rox参比染料用量（0.2～0.5 ?L）及退火温度（54～64 ℃）等反应条件逐一进行优化，以确定荧光定量PCR的最佳反应条件。在此条件下，以2.85×109～2.85×103拷贝/?L的重组质粒pMCR-1为模板进行PCR扩增，绘制扩增曲线和标准曲线。

1. 4 特异性、敏感性及重复性试验

以重组质粒pMCR-1及上述4种质控标准菌株的总DNA为模板、灭菌双蒸水为阴性对照，进行TaqMan-MGB荧光定量PCR扩增，以验证其特异性。以2.85×106～2.85×100拷贝/?L的重组质粒pMCR-1为模板进行TaqMan-MGB荧光定量PCR扩增，同时以2.85×109～2.85×101 拷贝/?L的重组质粒pMCR-1为模板进行常规PCR扩增，确定其敏感性。此外，以2.85×108～2.85×104拷贝/?L的重组质粒pMCR-1为模板进行重复性试验，计算其变异系数。

1. 5 临床应用

将82株广西鸡源致病性沙门氏菌分离株接种于LB培养液中37 ℃培养18～20 h，取培养菌液，采用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取总DNA后，应用建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测mcr-1基因。

2 结果与分析

2. 1 重组质粒pMCR-1鉴定结果

以包含mcr-1基因309 bp片段的质粒为模板，利用引物对（MCR-1F/MCR-1R）扩增目的片段（133 bp），然后克隆至pMD18-T载体上构建重组质粒，并命名为pMCR-1。经PCR扩增、双酶切鉴定及测序分析正确后（图1），作为阳性标准品用于后续试验。根据OD260 nm/OD280 nm，可计算得到重组质粒pMCR-1的浓度为109.989 μg/mL，即2.85×1010拷贝/μL。

2. 2 最佳反应条件

通过对引物、探针、Rox参比染料用量及退火温度进行优化试验，结果确定TaqMan-MGB荧光定量PCR最佳反应体系20.00 ?L：Premix Ex TaqTM 10.00 μL，Rox参比染料（50×）0.25 ?L，引物MCR-1F/MCR-1R（10 ?mol/L）各0.50 ?L，MCR-1-P探针（10 ?mol/L）0.50 ?L，重组质粒pMCR-1（模板）2.00 μL，灭菌双蒸水6.25 ?L。扩增程序：95 ℃预变性20 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，进行40个循环。

2. 3 TaqMan-MGB荧光定量PCR的标准曲线

以2.85×109～2.85×103拷贝/?L的重组质粒pMCR-1为模板，于最佳反应条件下进行TaqMan-MGB荧光定量PCR扩增，获得的扩增曲线及标准曲线如图2所示。标准曲线相关系数R2为0.999，即线性关系良好。

2. 4 特异性试验结果

以重组质粒pMCR-1及4种质控标准菌株的DNA为模板，进行TaqMan-MGB荧光定量PCR特异性试验，结果表明，只有重组质粒pMCR-1可特异扩增出预期的目的产物（图3），其他质控标准株及阴性对照均未扩增出任何产物，说明该方法特异性强。

2. 5 敏感性试验结果

以2.85×106～2.85×100 拷贝/?L的重组质粒pMCR-1为模板，进行TaqMan-MGB荧光定量PCR的检出下限为2.85拷贝/?L（图4）；以2.85×109～2.85×101 拷贝/?L的重组质粒pMCR-1为模板，进行常规PCR的检出下限为2.85×102 拷贝/?L（图5），即TaqMan-MGB荧光定量PCR的敏感性是常规PCR的100倍。

2. 6 重复性试验结果

以2.85×108～2.85×104拷贝/?L的重组质粒pMCR-1为模板进行TaqMan-MGB荧光定量PCR重复性试验，结果显示，组内和组间重复性试验的变异系数为0.37%～1.18%（表2），均小于1.20%，即重复性好。

2. 7 临床样品检测结果

采用建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR对82株广西鸡源致病性沙门氏菌分离株进行检测，结果未发现有携带mcr-1基因的菌株。

3 讨论

当前，携带mcr-1基因的细菌主要集中在大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌和阪崎肠杆菌等，来自人源、动物源、食品源及环境源等（王秀娜等，2017；易灵娴等，2017）。mcr-1基因由质粒携带，可通过流行性质粒或可移动元件在不同国家和地区的人源、动物源和环境源多种细菌间广泛傳播，且携带该基因的质粒具有多样性和复杂性，一旦呈全球性传播和蔓延，势必给畜牧业生产及公共卫生安全带来全新的挑战，因此亟待建立针对mcr-1基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法，为监控mcr-1基因携带细菌提供技术支持。自mcr-1基因（Liu et al.，2016）被发现以来，携带此基因的细菌种类日益增多，已严重威胁畜牧业发展及公共卫生安全（Chen et al.，2017；Gay et al.，2017），因此迫切需要加强对携带mcr-1基因耐药细菌的监控。至今，针对mcr-1基因检测技术的研究已有报道。Cannatelli等（2016）建立了检测mcr-1基因的PCR；Chabou等（2016）、von Wintersdorff等（2016）建立了针对mcr-1基因的TaqMan荧光定量PCR；在此基础上，Li等（2017）建立了SYBR Green荧光定量PCR检测方法，Imirzalioglu等（2017）、Zou等（2017）建立了环介导等温扩增技术（LAMP）。这些检测方法均可特异性扩增出mcr-1基因，也未出现与其他基因的交叉反应；对模板的检出下限表现为：常规PCR为103拷贝/μL数量级，SYBR Green荧光定量PCR和LAMP为102拷贝/μL数量级，TaqMan荧光定量PCR为101拷贝/μL数量级。本研究首次建立针对mcr-1基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR，其检测下限为2.85拷贝/μL，属于101拷贝/μL数量级，敏感性与TaqMan荧光定量PCR相当，是SYBR Green荧光定量PCR和LAMP的10倍，是常规PCR的100倍。即临床上可用于监控mcr-1基因携带细菌的突变规律。

沙门氏菌是主要的人畜共患病原菌之一，目前国内外均已发现有携带mcr-1基因的沙门氏菌分离株。Campos等（2016）对2002～2015年来自葡萄牙的1010株人源、猪源沙门氏菌进行检测，结果显示，从2011～2015年的分离株中均能检测到mcr-1基因，其中人源分离株阳性率为0.8%（4/522）、猪源分离株阳性率为2.4%（7/296）。Carnevali等（2016）对2012～2015年来自意大利的4473株沙门氏菌分离株（人源3294株、动物源1143株、环境源36株）进行检测，结果表明，mcr-1基因阳性率在人源分离株为0.3%（10/3294）、在动物源分离株为1.3%（15/1143）、在环境源分离株为0。EI Garch等（2018）通过检测2002～2014年来自欧洲11个国家的1174株动物源沙门氏菌，结果发现mcr-1基因阳性率为0.2%（2/1174）。在我国，曹阳等（2017）对2011～2014年分离的404株非伤寒沙门菌（人源204株、动物源128株、食品源72株）进行检测，结果仅在1株人源沙门菌中检测到mcr-1基因；Cui等（2017）检测了2012～2015年分离的2034株人源沙门氏菌，结果显示mcr-1基因阳性率为1.4%（28/2034）；Yi等（2017）通过检测2013～2014年从屠宰场分离的142株猪源沙门菌，结果发现mcr-1基因检出率为14.8%（21/142）。本课题组于2013～2017年从广西各地疑似患沙门氏菌病的病死鸡群中分离鉴定出82株致病性沙门氏菌，药敏试验证实这些分离株对苯唑西林、阿莫西林、链霉素、磺胺甲恶唑、四环素和呋喃妥因等多种抗菌素表现出多重耐药（黎宗强等，2016），对多黏菌素E的耐药率为40.24%（33/82），但以本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR进行检测，未发现携带mcr-1基因的菌株，具体原因有待进一步探究。

4 结论

针对mcr-1基因建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点，可用于临床筛查mcr-1基因，为监控mcr-1基因携带细菌提供技术支持。

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（責任编辑 兰宗宝）