运输胁迫对四指马鲅幼鱼肝脏、鳃和脾脏组织结构的影响

刘奇奇　温久福　区又君　李加儿　周慧

摘要：[目的]探究运输胁迫对四指马鲅（Eleutheronema tetradactylum）幼鱼肝脏、鳃、脾脏组织结构的影响，提高种苗运输存活率，为其规模化养殖提供技术支持。[方法]以四指马鲅幼鱼为研究对象，分别设对照组（未运输）、混合组（运输，同时添加抗应激混合物）和空白组（运输，不添加任何抗应激剂），抗应激剂为维生素c：谷氨酰胺=1：1。混合组和空白组幼鱼经6 h运输后分别取样（肝脏、鳃和脾脏），经石蜡切片和HE染色，显微镜下观察测定肝脏、鳃和脾脏的细胞形态、组织结构、生活及生理状态。[结果]对照组幼鱼表现正常，未出现死亡现象，混合组幼鱼的累计死亡率为12.5%，空白组的累计死亡达27.5%。对照组幼鱼的各组织均呈正常形态；混合组幼鱼的肝脏部分区域细胞排列疏松，肝小板结构不清晰；空白组幼鱼的肝脏组织整体失去固有形态，肝小板结构消失不见，大部分细胞核变性呈椭圆形或纺锤形。混合组幼鱼的鳃丝排列混乱，少数鳃小片末端或整体肿胀，血窦内红细胞出现部分堆积现象，线粒体丰富细胞体积变大；空白组的鳃小片整体肿胀，血窦加粗，部分鳃小片因红细胞过多而胀破，线粒体丰富细胞体积变大且数量增多。混合组幼鱼的脾脏白髓区域相对增大，黑色素-巨噬细胞中心数量及大小均有所增加；空白组幼鱼的脾脏组织红髓区域占据大部分，白髓区域相对较少，呈零散分布，巨噬细胞中心减小。[结论]运输胁迫导致四指马鲅幼鱼肝脏、鳃及脾脏组织损伤，抗应激剂混合物虽然在一定程度上起到缓解作用，但并不能完全消除。

关键词：四指马鲅；运输胁迫；肝脏；鳃；脾脏；组织损伤；抗应激剂

0引言

[研究意义]四指马鲅（Eleutheronema tetradactylum）俗称午鱼、马友等，隶属于鲻形目（Mugiliformes）马鲅科（Polynemidae）四指马鲅属（Eleutheronema）（孙典荣和陈铮，2013），因具有肉质鲜美、抗病力强、生长迅速等优点而深受广大养殖户青睐，现已发展成为新兴水产养殖品种之一。随着四指马鲅人工繁育技术的攻克，目前在我国台湾、广东、海南、浙江等地已有人工养殖（谢木娇等，2016a），且养殖规模和市场占有率逐年扩大，但四指马鲅抗应激能力较弱，尤其种苗极易受运输等人为活动的影响，是制约四指马鲅规模化养殖的重要因素。因此，加强四指马鲅种苗抗应激能力研究，解决长途运输种苗存活率的问题，对促进其养殖业的健康快速发展具有重要意义。[前人研究进展]至今，有关四指马鲅的研究已有较多报道，包括不同发育阶段消化道组织学比较（谢木娇等，2016b）、受精卵和仔鱼对不同盐度的耐受性（谢木娇等，2016c）及消化道黏液细胞的发育规律（谢木娇等，2015；谢木娇等，2016a）等。此外，Zischke等（2009）、Moore等（2011）以寄生虫的种群结构推测寄主遗传结构，系统分析了澳大利亚东部及北部四指马鲅的遗传结构；Newman等（2011）、Ballagh等（2012）分别以同位素标记及生活史特征研究澳大利亚北部四指马鲅的种群结构；林少珍等（2012）利用COI基因序列对我国东南沿海四指马鲅种群的遗传结构进行分析；罗海忠等（2015）采用盐度渐变法研究5种盐度对四指马鲅幼鱼生长及其鳃丝Na+/K+-ATP酶的影响。上述研究结果为四指马鲅的养殖生产提供了科学依据。[本研究切入点]应激是机体对外界或内部各种异常刺激所产生的非特异性全身反应，是生物体在长期进化中形成的一种适应性和防御性功能。鱼类极易受水环境及其他外界环境的影响从而产生应激反应，对其健康造成不利影响，尤其是长期应激胁迫会降低机体的抵抗力和生长速率等（孙鹏等，2014），但目前有关环境胁迫影响四指马鲅的研究鲜见报道。[拟解决的关键问题]通过对比运输胁迫前后四指马鲅幼鱼肝脏、鳃及脾脏的显微结构变化，探究四指马鲅应对运输胁迫的应答规律，旨在提高种苗运输存活率，为其规模化养殖提供技术支持。

1材料与方法

1.1试验材料

供试四指马鲅幼鱼于2016年6-9月在南海水产研究所珠海试验基地培育获得，体长11.0±0.5 cm，体质量24.0±1.5 g。试验开始前进行驯养，使其适应环境，期间每天换水1次，每次换水量1/2左右，连续充气增氧。驯养1周后随机挑选90尾体色正常、健康的幼鱼用于试验。

1.2试验方法

在水温25℃、pH 8.0±0.2、溶解氧6.0±0.5 mg/L的条件下，将四指马鲅幼鱼随机平均分为3组，即对照组（未运输）、混合组（运输，同时添加抗应激混合物）和空白组（运输，不添加任何抗应激剂）。对照组幼鱼（30尾）用MS-222麻醉2-3 min，取其肝脏、鳃和脾脏样品固定于4%多聚甲醛溶液中。同时取6个相同规格的暂养桶（直径1.3 m、高1.5 m，加水量约占总体积的80%），其中3个暂养桶（混合组）参考周传朋等（2014）的方法在养殖水中添加维生素C：谷氨酰胺=1：1的抗应激剂混合物，使其浓度为20 mg/m3；另外3个暂养桶（空白组）的养殖水不添加抗应激剂。每个桶暂养10尾四指马鲅幼鱼，以中型卡车在公路上正常行驶6 h。运输结束时，以同样方法取肝脏、鳃和脾脏样品，固定于4%多聚甲醛溶液中。

1.3测定项目及方法

参照陈世喜等（2017）的方法，取出4%多聚甲醛固定的四指馬鲅幼鱼肝脏、鳃和脾脏样品，经流水冲洗、70%-100%乙醇脱水和二甲苯透明，以石蜡包埋处理后用Leica切片机进行连续切片，切片厚度5-6pm，采用HE染色和中性树脂封片，于Zeiss显微镜下观察拍照。观察测定项目包括幼鱼肝脏、鳃和脾脏的细胞形态、组织结构及其生活生理状态。

2结果与分析

2.1运输胁迫前后四指马鲅幼鱼的生活状态及死亡率

对照组幼鱼表现正常，沿暂养池壁集体朝同一方向不停游动，未出现死亡现象；混合组幼鱼在运输期间向不同方向快速、混乱游动，并撞击桶壁，有少数幼鱼死亡，累计死亡率为12.5%；空白组幼鱼在运输初期与混合组无明显区别，但随着运输时间的延长，幼鱼游动速度明显减慢，且动作不协调，有的甚至呈侧游或翻身游动，运输结束后的累计死亡率达27.5%。

2.2运输胁迫对四指马鲅幼鱼肝脏组织的影响

对照组幼鱼的肝细胞呈多面体紧密排列，细胞核大而圆，多为单核，居细胞中央，且着色较深，部分细胞出现因糖原溶解形成的空泡；肝小板和肝血窦沿中央静脉呈放射状相间排列，结构清晰；中央静脉位于肝小叶中部，周围有许多肝血窦开口，其横切面呈圆形，均表现为正常形态（图1-1、图1-2和图1-3）。混合组幼鱼的肝脏受到较轻微损伤，主要表现为肝细胞空泡消失，形状不规则，部分区域细胞排列散乱，部分细胞核着色较深；肝小叶及肝小板结构不清晰，肝血窦间隙增大；中央静脉横切面呈不规则形状（图1-4、图1-5和图1-6）。空白组幼鱼的肝组织受到严重损伤，主要表现为整体肝细胞核失去固有形态，细胞排列松散且不规则，大部分细胞核变性呈椭圆形或纺锤形，着色较浅，空泡消失；肝小板及肝小叶结构消失不见；中央静脉周围肝血窦开口较大，其横切面呈不规则形状且内部充满血细胞（图1-7、图1-8和图1-9）。

2.3运输胁迫对四指马鲅幼鱼鳃组织的影响

对照组幼鱼鳃组织中线粒体丰富细胞呈椭圆形，分布在鳃小片基部，上皮细胞呈扁平状规则排列；血窦内均匀分布有红细胞，两侧的鳃小片对称且完整，鳃丝密集且排列整齐，其结构表现为正常的生理形态（图2-1、图2-2和图2-3）。与对照组相比，混合组幼鱼鳃组织中线粒体丰富细胞体积变大；血窦收缩，其红细胞分布不均匀，出现部分堆积现象；鳃小片呈S形扭曲且排列不规则，大部分鳃小片弯曲，少数鳃小片末端或整体肿胀；鳃丝排列不整齐，部分鳃丝中间开裂，且着色力减弱（图2-4、图2-5和图2-6），表明运输胁迫对鳃组织已造成一定损伤，但并不严重。空白组幼鱼鳃组织中线粒体丰富细胞体积变大且数量增多，大部分上皮细胞水肿变性，部分表皮出现脱落现象；鳃小片整体肿胀，血窦增宽，红细胞分布不均匀，部分鳃小片因红细胞过多而胀破；鳃丝整体水肿，部分鳃丝中间开裂，其整体偏离正常形态（图2-7、图2-8和图2-9），表明运输胁迫对鳃组织造成严重损伤。

2.4运输胁迫对四指马鲅幼鱼脾脏组织的影响

对照组幼鱼脾脏组织网状支架上分布极密集的淋巴细胞，最外层可观察到被膜，局部可见由被膜结缔组织形成的小梁结构；被膜以下由红髓和白髓交替分布形成密集网状结构的脾脏实质，分布有大量的淋巴细胞和巨噬细胞；在红髓周围稀散分布的为白髓结构，区域面积相对红髓区域要小很多，内部分布有密集的淋巴细胞（图3-1、图3-2和图3-3）。与对照组相比，混合组幼鱼的脾脏组织受到一定损伤，但并不严重，表现为白髓区域增大，黑色素一巨噬细胞中心数量及大小均有所增加；边缘区面积增加（图3-4、图3-5和图3-6）。空白组幼鱼脾脏严重损伤，表现为组织中充满红细胞，红髓与白髓相对较少，呈零散分布，巨噬细胞中心数量和边缘区域面积均减小（图3-7、图3-8和图3-9）。

3讨论

与自然条件下相比，鱼类在集约化养殖过程中需经受更多人为因素的干扰，但在长期进化过程中鱼类已形成了相应的调节机制。刘小玲（2007）研究表明，轻度刺激可促进鱼类生长，改善鱼类体质，但剧烈或长期刺激会干扰鱼类的正常生理功能，导致机体功能紊乱，甚至死亡。肝脏是鱼类最大的消化腺，可分泌胆汁促进脂肪的分解与吸收，又参与多种物质的合成、储存、代谢和转化。肝细胞内含有多种内含物，主要有糖原、脂滴及色素等，且其含量与机体的生理状态密切相关。彭士明等（2011）研究表明，运输胁迫下银鲳（Pampus argenteus）的机体能量供给主要来自肝脏糖元分解。本研究中，由于分组过程中幼鱼受到惊吓，导致其肝糖元的代谢与合成平衡被打乱，可能是对照组四指马鲅幼鱼肝脏组织出现空泡的原因。Johnston等（1989）对虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的研究表明，维生素C可通过神经调节因子调节脑部激素水平，调控鱼类行为以增强其抗应激能力。黄玉萍等（2010）研究表明，抗应激复合物可有效提高团头鲂（Megalobrama amblycephala）的抗应激能力，降低应激对肝脏等组织的损伤。此外，徐洋等（2011）研究证实谷氨酰胺可促进肠道黏膜修复、淋巴细胞增殖、巨噬细胞分裂和分化，在免疫调节方面具有重要意义。本研究中，混合组幼鱼肝细胞空泡消失可能是抗应激剂对鱼类能量代谢起调解作用。运输过程中幼鱼因受到惊吓而剧烈挣扎游动，其能量代谢及耗氧量随之增加，为满足机体对氧的需求，故肝血窦间隙增大、血流加快；部分肝细胞排列散乱及不规则的中央静脉横切面，其原因可能是运输过程中幼鱼不断撞击桶壁导致肝脏组织发生机械性损伤。四指马鲅幼鱼的肝脏组织在运输胁迫后失去固有形态，其生理状态趋于崩溃，累计死亡率高达27.5%，与Zhang等（2004）的研究结果相似。总之，运输胁迫会对四指马鲅幼鱼的肝脏造成损伤，添加抗应激剂混合物可起到一定的缓解作用，但无法从根本上消除。

鳃是鱼类的主要呼吸器官，同时具有排泄氨氮等代谢废物及调解渗透压的功能。本研究中，混合组幼鱼鳃线粒体丰富细胞体积变大的现象与高盐度下卵形鲳够（Trachinotus ovatus）线粒体丰富细胞（区又君等，2013）的变化相同，表明运输应激破坏了四指马鲅幼鱼的渗透压平衡，少数鳃小片末端或整体出现肿胀现象。与肝组织相同，在抗应激剂混合物作用下四指马鲅幼鱼的鳃基础代谢增加、血流加快，但由于运输胁迫致使血窦收缩，从而导致红细胞分布不均匀，出现部分堆积现象，与陈彩芳等（2012）对泥蚶（Tegillarca granosa）的研究结果相似。本研究中，混合组幼鱼鳃小片呈S形扭曲且排列不规则，可能是运输过程中幼鱼剧烈挣扎，加上渗透压遭到破坏，鳃小片局部吸水所造成。空白组幼鱼线粒体丰富细胞体积变大且数量增多，与盐度胁迫遮目鱼（Chanos chanos）幼鱼的试验结果（区又君等，2014）相似，表明四指马鲅幼鱼为克服运输胁迫，调动相关生理反应而消耗大量能量。四指马鲅幼鱼鳃组织上皮细胞水肿变性，部分表皮脱落，表明运输胁迫导致鳃Na+/K+-ATP酶活性下降，即在无抗应激剂的条件下幼鱼鳃功能遭到破坏。可见，运输胁迫致使四指马鲅幼鱼鳃组织出现不同程度的损伤，添加抗应激剂能起到明显的缓解作用。

脾脏主要由淋巴组成，在鱼类的造血、免疫及储血方面发挥着重要作用。低盐胁迫下，许氏平触（Sebastes schlegeli）脾脏组织中淋巴细胞数量增多，且呈聚集现象（王晓杰等，2006）。本研究中，混合组幼鱼脾脏组织的变化与低盐胁迫下许氏平触脾脏组织的变化相似，表明抗应激剂在一定程度上能提高受运输胁迫幼鱼的免疫反应能力，促使免疫细胞的数量合成增加。王文博等（2004）对草鱼（Ctenopharyngodon idellus）的研究表明，拥挤胁迫会对鱼类脾脏器官造成极大损伤。运输胁迫下四指马鲅幼鱼脾脏组织的白髓及巨噬细胞中心数量均相对减少，说明其免疫系統已无法抵御运输胁迫的干扰，免疫细胞合成受阻，与王晓杰等（2006）的研究结果相似，表明长期处于应激胁迫下鱼类免疫力易受到明显影响，因此在养殖生产过程中应避免长期的逆境胁迫。

实际生产中，采取以下措施能有效提高鱼类的抗应激能力（王庆萍等，2013）：（1）运输过程中应避免多重应激；（2）尽量缩短运输时间；（3）避免在高温季节运输；（4）长途运输前宜禁食2-3 d，以减少应激时的耗氧量；（5）可在饵料中适当添加维生素C、谷氨酰胺等抗应激剂。此外，Verbeek等（2008）研究证实，鱼类的早期应激经历可增强其后期抗应激的适应能力，即通过适当驯化可有效提高鱼类的抗应激能力；邝哲师等（2011）、Bacarin等（2015）研究表明，饵料中添加乳酸菌、不饱和脂肪酸或鱼油等也可改善鱼类体质，提高其抗应激能力。因此，在饵料中适量添加益生菌或不饱和脂肪酸等，可能是提高四指马鲅运输存活率的有效途径之一。

4结论

运输胁迫导致四指马鲅幼鱼肝脏、鳃及脾脏组织损伤，抗应激剂混合物虽然在一定程度上起到缓解作用，但并不能完全消除。