基于表型性状和KASP标记的玉米DUS测试品种的聚类分析

王艳平， 潘 红， 吴 燕， 王显生， 汪鸿星， 李华勇， 于 堃， 沈 奇

(江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所，江苏南京210014)

玉米是中国种植范围最广、用途最多、总产量最高的作物，玉米产业的发展在保障中国粮食安全和满足市场需要方面具有至关重要的作用[1]。良种培育是保证玉米正常生产的关键，近年来国家对种业研发提供了大量政策支持，提高了企业研发的积极性。2014年中国颁布了《国家级水稻玉米品种审定绿色通道试验指南》(简称《指南》)以简化审定程序，随后，中国审定的玉米品种数量迅猛增长。近3年来，中国每年审定的玉米品种有2 000～3 000份，每年申请品种保护的玉米品种有2 000多份[2]。2016年中国实施的新《种子法》中规定，获得品种保护和审定的玉米品种都要满足品种特异性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和稳定性(Stability)(简称DUS)测试的要求，目前中国每年都有大量玉米品种接受DUS测试。

DUS 测试是品种权授权、品种审定和品种登记的基本技术依据，其中特异性测试在真实性评价、假冒侵权品种技术鉴定中尤为重要。特异性是指一个植物品种有一个以上性状明显区别于已知品种。近似品种是指在所有已知品种中，相关特征或者特性与待测品种最为相似、在DUS测试中用于田间比对的品种。由此可见，筛选近似品种是DUS测试的重要环节，对特异性的判定起着决定性作用。当前，特异性测试主要是根据植物测试指南中表型性状的描述，在已知品种库中筛选与申请品种表型近似的品种并进行田间种植比较。这种根据表型性状筛选近似品种的测试方法在DUS测试实践中存在一些缺陷：一是耗时长，必须对申请品种进行一年的种植试验，获得表型性状数据后才能与数据库中的所有品种进行比对；二是现有的植物新品种保护数据库包括全国各生态区的测试数据，直接用不同生态区的表型性状数据进行比对时存在环境误差。

分子数据因具有标记位点多、检测快速准确、不受环境因素影响等优点，在筛选近似品种方面能够高效鉴定大量的品种。国际植物新品种保护联盟(UPOV)技术委员会于1992年成立了生物化学和分子技术工作组(BMT)，专门研究DNA分子标记在DUS测试中的应用。目前，研究者主要运用简单重复序列(SSR)分子标记辅助DUS测试。UPOV认为，SSR标记是可以用于构建DNA指纹数据库的一种理想的分子标记，并为其应用制定了相应的技术文件指导[3]。Hong等[4]用表达序列标签-SSR(EST-SSR)标记构建了莴苣DNA指纹数据库，并将其用于莴苣品种的近似品种筛选和特异性判定。中国在2013年发布了玉米等10多种作物的SSR标记法品种鉴定技术规程。农业农村部植物新品种测试(济南)分中心采用发布的技术规程构建了小麦、大白菜已知品种的DNA指纹数据库，并用DNA指纹数据库筛选了小麦DUS测试品种的近似品种[5]。

目前使用的品种鉴定技术规程——SSR分子标记法，标记数目有限、信息量较少，且不能满足大量样本高通量检测的需求。近年来，由于芯片技术具有标记数量多、自动化程度高等优点，利用其研发的单核苷酸多态性(SNP)检测技术得到快速发展和应用[6-7]。法国专家Delêtre[8]在2020年的UPOV生物化学和分子技术工作组第19次会议上讲述了一种用SNP分子标记检测冬油菜DUS的策略，美国的Achard等[9]已将SNP技术运用到大豆品种保护的DUS测试中。

SNP检测技术中的竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive allele-specific PCR，KASP)标记检测法具有稳定性高、准确性高、成本低的特点，可用于各种目的、各种物种的基因分型，在需要少量到中等数量标记的检测中可显示成本效益和可扩展的灵活性[10]，目前已被广泛应用到大麦[11]、小麦[12]、水稻[13]、玉米[14-16]等作物品种的检测中。陆海燕等[14]基于205份玉米自交系重测序数据, 过滤出1 660 336个SNP位点, 并根据这些位点开发、挑选出202个能有效鉴定玉米品种特异性和真实性的KASP标记。江苏省于2020年发布了利用KASP标记检测的地方标准《玉米品种及纯度鉴定技术规程SNP标记法》(DB32/T 3860-2020)[17]，该标准推荐了优先使用的40个KASP标记。本研究利用表型性状和上述标准中可用于品种鉴定的40个KASP分子标记，分别对315份玉米的DUS测试品种进行聚类，分析玉米DUS测试品种群体的遗传多样性，初步探讨KASP标记在玉米DUS测试中应用的潜力，以期为玉米DUS测试中近似品种的筛选提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

315份玉米DUS测试品种(表1)，来源于农业农村部植物新品种测试(南京)分中心，繁殖类型包含223份单交种、92份自交系，品种类型包含163份普通型、63份甜质型、55份糯质型和34份甜糯混合型。供试玉米材料来源广泛，大部分品种来源于长江中下游地区的江苏、浙江、上海、安徽等地，少数品种来源于湖北、河北、河南、山东、天津、北京、四川、福建、江西、广东等地。

表1 供试玉米品种

1.2 表型数据的采集及聚类分析

试验材料于2020、2021年春种植于江苏省农业科学院溧水植物科学基地。按照《植物品种特异性、一致性和稳定性测试指南 玉米》(GB/T 19557.24-2018)[18]规定的测试方法对测试指南中列出的43个基本性状进行观测和记录，目测性状用代码记录，测量性状用测量值记录。使用SPSS 26软件，采用对数似然值距离测量以及施瓦茨贝叶斯准则(BIC)进行二阶聚类，用欧氏距离构建系统聚类图。

1.3 KASP标记的基因分型及聚类

在玉米的3～4叶期，每个品种剪取5株幼苗的叶片，参照《玉米品种及纯度鉴定技术规程SNP标记法》(DB 32/T 3860-2020)[17]中列出的40个KASP标记，按照本标准规定的方法提取样品DNA并进行PCR扩增。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，委托南京集思慧远生物科技有限公司进行基因分型。使用TASSEL 5软件，通过Neighbor-Joining方法构建进化树，用FigTree软件处理聚类图。

2 结果与分析

2.1 玉米表型性状的聚类分析

由表2可以看出，将基于43个玉米表型性状的数据进行二阶聚类，315份玉米品种被聚为3类，第1类有162份品种，除1份为糯质型外，其他全部为普通型；第2类有92份品种，除2份为甜质型，2份为普通型外，其他全部为糯质型或甜糯混合型；第3类有61份品种，全部为甜质型。

表2 315份玉米品种基于表型性状数据的二阶聚类分布

对43个玉米表型性状的重要性进行预测，由图1可以看出，“籽粒:类型”、“(仅适用于单色玉米)籽粒:顶端主要颜色”、“雄穗:一级侧枝数目”和“幼苗:第一叶鞘花青苷显色强度”这4个性状的重要性在0.5以上，对聚类的贡献排名位于前4名。

编号1～43采用的是测试指南《植物品种特异性、一致性和稳定性测试指南 玉米》(GB/T 19557.24-2018)中规定的性状序号。

对315份玉米品种的表型性状观测数据进行系统聚类，并将聚类结果整理成表3、图2。以欧氏距离25.0为标准，可将315份玉米材料划分为A、B两大类群。A类群包含273份玉米品种(包括58份自交系和215个单交种)，单交种除6份玉米品种聚于B群外，全部聚于A类群。B类群包含42份玉米品种，其中36份玉米品种是自交系，占全部自交系数量的39.1%。以欧氏距离12.5为标准，可将A类群划分为A1、A2和A3等3个亚群，其中A1亚群包含154份玉米品种，其中17份为自交系(占全部自交系数量的18.5%)，137份为单交种(占全部单交种数量的61.4%)；A2亚群包含115份玉米品种，其中74份为单交种，41份为自交系；A3亚群包含4份玉米品种，全部是单交种。以欧氏距离10.0为标准，可将A2亚群再划分为A2-1、A2-2这2个亚群，其中A2-1亚群包含76份玉米品种，其中70份为单交种(占全部单交种数量的31.4%)，6份为自交系；A2-2亚群包含39份玉米品种，其中35份为自交系(占全部自交系数量的38.0%)，4份为单交种。从品种类型来看，B类群包含29份普通型、7份甜质型、5份糯质型和1份甜糯混合型。A1亚群包含82份普通型、36份甜质型、18份糯质型和18份甜糯混合型；A2亚群包含58份普通型、21份甜质型、19份糯质型和17份甜糯混合型；A3亚群包含4份玉米品种，全部是普通型。A2-1亚群包含19份普通型、19份甜质型、21份糯质型和17份甜糯混合型；A2-2亚群全部是普通型。上述系统聚类结果显示，单交种和自交系在表型上的分离相对比较明显，普通型与甜质型、糯质型、甜糯混合型在表型上的分离较明显，而甜质型、糯质型、甜糯混合型三者之间的分离不明显。

图2 不同类型玉米品种在所划分类群中的分布

表3 不同类型玉米品种在各类群中的分布

2.2 KASP标记聚类分析

采用覆盖玉米10条染色体的40个KASP标记对315份玉米品种进行基因分型，每条染色体设4对多态性引物。这40个KASP标记位点在315份玉米品种群体中的多态信息含量(PIC)变化范围为0.430～0.500，平均值为0.482，最小等位基因频率(MAF)变化范围为0.313～0.498, 平均值为0.420，表明所采用的40个KASP标记具有较高的特异性和稳定性。

用Neighbor-Joining法对315份玉米品种进行聚类。由图3可以看出，315份玉米品种分成A、B两大群，其中A群包含154份玉米品种，除2个甜质型、7份糯质型外全为普通型；B群包含161份玉米品种，其中除17份为普通型外，其他为甜质型、糯质型和甜糯混合型。B群又可分成为B1、B2、B3和B4 4个亚群，其中B1亚群包含64份玉米品种，除2份为糯质型、2份为甜糯混合型外，其他全部为甜质型。B2亚群包含79份玉米品种，B3亚群包含7份玉米品种，B2、B3这2个亚群中除9份为普通型外，其他全部为糯质型、甜糯混合型。B4亚群包含11份玉米品种，其中2份为糯质型，1份为甜糯混合型，8份为普通型。

图3 315份玉米品种的KASP标记基因分型聚类结果

上述聚类结果显示，在DNA水平上，普通型玉米与甜质型、糯质型和甜糯混合型玉米明显分离，甜质型玉米与糯质型、甜糯混合型玉米也明显分离，而糯质型和甜糯混合型玉米是相互交织，没有出现明显分离。在繁育类型上，单交种和自交系没有各自成群，自交系与单交种交织在一起。

3 讨论与结论

目前，植物品种的DUS测试仍然是以表型性状的观测数据为依据，但是分子标记尤其是SNP标记技术的应用越来越受到重视[19-23]，UPOV已经将SNP标记作为农作物品种鉴定和指纹数据库构建的方法之一[24]。

为了探讨SNP标记在玉米DUS测试中的应用，本研究采用具有高稳定性、高准确性、低成本等优点的KASP标记检测法和玉米DUS测试的表型观测法，对315份DUS测试玉米品种群体进行聚类分析比较。供试品种涵盖当前中国大部分地区育成的各类品种，繁育类型包括自交系和单交种，品种类型包括普通型、甜质型、糯质型和甜糯混合型。

表型性状的系统聚类结果显示，在繁殖类型上，单交种和自交系之间的分离比较明显；在品种类型上，普通型与甜质型、糯质型、甜糯混合型间的分离相对较明显，而甜质型、糯质型、甜糯混合型三者之间的分离不太明显。通过表型的二阶聚类，将品种类型分为普通型、甜质型、糯质型+甜糯混合型3类，甜质型与糯质型和甜糯混合型玉米分成不同的类群，这是因为表型性状数据中包含类别变量和连续变量。二阶聚类分析结果显示，类别变量、连续变量具有快速、智能、准确的优点，适用于大样本及多变量的研究[25]，并可预测每个变量的重要性。在本研究中，“籽粒:类型”性状对聚类结果的影响最大，因此可以根据籽粒类型将供试玉米品种分成普通型、甜质型、糯质型+甜糯混合型3种类型。

在DNA水平上，针对不同繁殖类型，王凤格等[26]利用40对SSR标记分析了中国559个代表性玉米品种资源的遗传多样性，发现在自交系和杂交种之间存在较小的遗传多样性差异。本研究的KASP标记聚类结果也显示，单交种和自交系没有各自成群，而是自交系与单交种交织在一起，表明单交种可能是由其中的自交系杂交而来，在亲缘关系上与其父母本自交系间存在更为亲近的关系。针对不同的籽粒类型，雷开荣等[27]利用SSR-PCR分子标记技术研究了不同种群玉米种质的遗传多样性，发现甜质型、糯质型玉米种质间的遗传距离变异幅度总体上小于它们与普通玉米间的遗传距离变异幅度。本研究中的KASP标记聚类结果也显示，普通型玉米与甜质型、糯质型、甜糯混合型玉米明显分开，同时甜质型玉米与糯质型、甜糯混合型玉米明显分开，而糯质型玉米和甜糯混合型玉米是相互交织，表明在分子水平上普通型玉米与甜质型、糯质型、甜糯混合型玉米之间具有明显的遗传差异，甜质型玉米与糯质型、甜糯混合型玉米之间也具有明显的遗传差异，而糯质型玉米和甜糯混合型玉米之间的差异较小。这是因为甜糯混合型玉米通常是以糯玉米自交系为母本、甜糯双隐性玉米自交系为父本杂交选育而来的[28-29]，仅糯质型玉米中引入了甜质基因。本研究结果表明，KASP标记能够应用在玉米品种遗传多样性分析和DUS测试的近似品种筛选方面，可以实现快速、高效、大量样本的高通量检测。

综合分析表型与KASP标记2种聚类结果发现，在繁殖类型上，单交种与自交系的表型聚类结果与分子标记聚类结果明显不同，在籽粒类型上，4种玉米品种类型之间在表型、分子水平上的差异基本吻合，表明不同类型的玉米品种在表型上的差异与DNA水平上的差异是不完全一致的。这个结果与韩瑞玺等[30]根据SSR标记在小麦上的研究结果所得出的DNA分子水平上的遗传相似度大小与表型距离无严格线性关系的结论相一致。玉米单交种的株高、果穗大小基本优于自交系，普通型、甜质型、糯质型、甜糯混合型玉米品种的籽粒外观差异也明显，表型聚类只能反映品种间表型上的相似程度，不能准确反映品种间DNA水平上的亲缘关系，而分子标记聚类是根据DNA序列上基因型的差异，能较准确地从遗传水平上反映各品种间的亲缘关系。Achard等[9]用SNP、形态学、生理学和系谱信息对322份已知大豆品种进行研究，对SNP数据和系谱亲缘数据的遗传距离进行多变量分析，发现品种间的关联非常相似，但是这种遗传水平上的亲缘关系不能全面反映品种间的表型差异。因此，在当前以表型为主的DUS测试中，为提高近似品种筛选的效率、减少误差，建议设立基于SNP标记的已知品种分子数据库，同时利用表型和分子数据库综合筛选近似品种。