江苏蚕豆三叶草黄脉病毒的分子鉴定及全基因组结构特征分析

高晓晓， 涂丽琴， 孙 枫， 李 硕， 崔晓艳， 陈 新， 章松柏， 季英华

(1.农林病虫害预警与调控湖北省工程技术研究中心/长江大学，湖北荆州434025；2.江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏南京210014；3.江苏省农业科学院经济作物研究所，江苏南京210014)

蚕豆(ViciafabaL.)是豆科野碗豆属的一个栽培种，属于一年生或两年生豆科植物。蚕豆是重要的冬季食用豆作物，富含蛋白质、氨基酸、微量元素、碳水化合物和维生素等营养成分；其用途广泛，可用于食品加工和养殖业饲料生产，属于重要的经济增收作物。中国蚕豆种植面积以及产量均位居世界首位[1]。但近年来在蚕豆生产过程中，病毒病发生种类呈现多样化态势，同时其造成的危害也有加重趋势，导致蚕豆产量减少和品质下降[2]。目前报道的侵染蚕豆的病毒主要有三叶草黄脉病毒(Clover yellow vein virus, ClYVV)、蚕豆染色病毒(Broad bean stain virus, BBSV)、菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus, BYMV)及芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)等类型[3]。病毒种类的多样化给蚕豆病毒病的高效防控提出了极大的挑战。

三叶草黄脉病毒(Clover yellow vein virus, ClYVV)属于马铃薯Y病毒科Y病毒属成员，主要侵染菜豆[4]、豌豆、蚕豆和扁豆[5]等多种豆科植物及一些观赏植物[6-7]。发病植株往往表现出顶部枯死、叶脉坏死和叶片脱落，同时豆荚变形坏死、发育迟缓[8]，严重时可引起植株全身扭曲变形并系统性坏死，极大地影响生产效益，给农户带来经济损失[9]。ClYVV最早由英国学者Hollings和Nariani从白三叶草中发现并分离[10]，之后西班牙[11]、美国[12]、澳大利亚[13]、韩国[14]等国的学者陆续地报道了该病毒对本国植物的危害。目前中国关于ClYVV的报道与研究相对较少。1989年，李长松等[4]从山东泰安菜豆病样中利用血清学方法检测到三叶草黄脉病毒。张趁华等[15]开展了侵染蚕豆ClYVV的鉴定与研究。

2018年，课题组在对江苏省蚕豆病毒病调查过程中，发现盐城蚕豆上出现疑似ClYVV危害的症状。为进一步确认该病害的病原体隶属的病毒种类并明确其全基因组结构特征，本研究拟利用分子手段对其进行鉴定，并通过分段扩增的方法获得ClYVV江苏蚕豆分离物全基因组序列，分析其基因组结构特征，明确其分类地位，为进一步研究ClYVV的致病机制与制定防控策略奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试样品

供试样品为2018年采集于江苏省盐城市蚕豆样品[16]，经液氮冷冻后，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 试剂

RANiso Reagent、PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit试剂盒、PrimeSTARTMMAX、pMD18-T购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)；TreliefTM5α大肠杆菌感受态细胞购自北京擎科生物公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司。

1.3 RNA提取

参照吴淑华等[17]的方法，利用Trizol法提取蚕豆样品总RNA，提取后置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.4 RT-PCR及ClYVV全基因克隆

以蚕豆疑似病样总RNA为模板，参照涂丽琴等[16]的方法进行反转录。针对已报道的ClYVV全序列设计5对分段引物(表1)，以cDNA为模板，分别扩增5段序列。PCR反应总体系40 μl: PrimeSTAR MAX 20 μl, F、R引物各2 μl，ddH2O 14 μl, cDNA 2 μl。扩增条件为94 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，重复34个循环；72 ℃ 5 min，12 ℃ 10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，利用Axygen试剂盒割胶回收后，连接至pMD18-T载体。利用热激法转化TreliefTM5α大肠杆菌感受态细胞，经PCR检测与酶切验证后将阳性克隆送至安徽通用生物公司进行序列测定。

表1 ClYVV基因片段扩增引物

1.5 ClYVV全基因序列分析

根据测序结果，将获得的5个片段序列进行拼接，利用DNAstar、Snap Gene、BioEdit、Clustal X等软件与NCBI上已公布的ClYVV 全基因序列进行基因组结构特征及多重序列比对分析，并利用BLAST网站进行同源性分析。利用MEGA7软件的邻接法(Neighbor-joining Algorithm)进行聚类分析以及系统进化树的构建，进化树的可信度使用1 000次自导复制验证。

2 结果与分析

2.1 病样田间采集及ClYVV检测

2018年，田间调查发现，盐城部分田块蚕豆植株叶片上卷皱缩、比较僵硬，同时会伴有坏死斑点，部分植株伴有褪绿等疑似病毒感染的症状(图1)。田间疑似病样采集后进行分子检测。在利用ClYVV特异性检测引物(ClYVV-CP-F和ClYVV-CP-R，表1)进行扩增时，发现从盐城市采集的33份样品中有19份能扩增到特异的目的片段(图1)。进一步测序验证后确认检测到的病毒为ClYVV，说明当地蚕豆上存在ClYVV的侵染危害。

A:健康蚕豆植株;B:发病蚕豆植株;C:盐城蚕豆阳性样品ClYVV特异性扩增图谱。M:DL 5000 marker;CK:阴性对照;a～s:盐城蚕豆阳性样品JS-1～JS-19。

2.2 ClYVV全基因组分段克隆

ClYVV基因组全长约9～10 kb，本研究采用分段扩增的策略(图2)，设计5对针对ClYVV全基因序列的特异性引物(表1)，利用蚕豆病样总RNA为模板反转录得到的cDNA分别进行PCR扩增。产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果5对引物均扩增到与目的大小相同的条带(图3a)。回收目的条带后，16 ℃连接pMD18-T载体，热激法转化TreliefTM5α大肠杆菌感受态细胞。经菌落PCR筛选阳性克隆后，再经酶切验证(图3b)后送至安徽通用生物公司进行序列测定。

图2 ClYVV分段克隆策略

M：Marker DL 5000 marker; Cl1～Cl5: ClYVV5个基因片段。

2.3 ClYVV江苏蚕豆分离物基因组特征分析

克隆片段序列测定后，基于重叠序列进行拼接获得完整ClYVV江苏蚕豆分离物(ClYVV-JS)全基因序列，并发布于NCBI GenBank数据库，序列登录号为OP296252。ClYVV-JS基因组全长9 585 bp，编码区可分为P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、6K2、CI、VPg、NIa-Pro、NIb和CP(图4)，编码11个功能蛋白。基因组的1～191 bp为5′非编码区，192～1 097 bp编码302 aa组成的相对分子质量约34 100的P1蛋白；1 098～2 468 bp编码457 aa组成的相对分子质量约52 200的HC-Pro蛋白；2 469～3 512 bp编码348 aa组成的相对分子质量约40 200的P3蛋白；2 469～3 160 bp+1bp编码230 aa组成的相对分子质量约26 000的P3N-PIPO蛋白，由P3的N段氨基酸和PIPO组成。3 513～3 671 bp编码53 aa组成的相对分子质量约5 900的6K1蛋白；3 672～5 576 bp编码635 aa组成的相对分子质量约71 400的CI蛋白；5 577～5 735 bp编码53 aa组成的相对分子质量约6 100的6K2蛋白；5 736～6 308 bp编码191 aa组成的相对分子质量约21 800的VPg蛋白；6 309～7 037 bp编码243 aa组成的相对分子质量约27 300的NIa-Pro蛋白；7 038～8 594 bp编码519 aa组成的相对分子质量约59 100的NIb蛋白；8 595～9 407 bp编码271 aa组成的相对分子质量约30 800的CP蛋白；9 408～9 585 bp为3′非编码区。

图4 ClYVV江苏蚕豆分离物基因组结构

2.4 ClYVV江苏蚕豆分离物全基因组序列聚类分析

根据ClYVV分段序列测序结果，拼接得到完整的ClYVV江苏蚕豆分离物全基因序列。利用BLAST网站与NCBI上已报道的ClYVV全基因序列进行比对。结果表明ClYVV江苏蚕豆分离物(ClYVV-JS)核苷酸序列与日本ClYVV No.30分离物(AB011819)同源性最高，达96.37%，与ClYVV安徽合肥分离物(KU922565)同源性为94.74%，而与马铃薯Y病毒属同属成员菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus, BYMV)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)、莴苣花叶病毒(Lettuce mosaic virus, LMV)、李痘病毒(Plum pox virus, PPV)、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus, WMV)、韭葱黄条病毒(Leek yellow stripe virus, LYSV)、豌豆种传黄化病毒(Pea seed-borne mosaic virus, PSbMV)的同源性仅达50%～70%(表2)。氨基酸序列比对结果显示ClYVV-JS与ClYVV日本No.30分离物(AB011819)氨基酸序列同源性最高，达99.06%，与其他ClYVV分离物氨基酸序列同源性为93.07%～98.99%(表2)。经Clustal W多重序列比对后，利用MEGA7软件邻接法进行1 000次自导复制验证构建系统发育树，结果显示ClYVV-JS与日本No.30分离物(AB011819)、韩国Dendrobium分离物(LC506604)、中国合肥分离物(KU922565)、韩国BH分离物(LC643587)、美国Ca分离物(MW287328)、日本90-1 Br2分离物(AB732962)、美国IA-2016分离物(MK292120)、日本I89-1分离物(LC096082)、韩国Gm分离物(KF975894)归入一个分支，相对近缘，而与德国NGSTPS18分离物(MW848532)归入不同分支，相对远缘，但它们都聚类到ClYVV大分支中(图5)。这些结果表明从江苏蚕豆上分离到的病毒属于三叶草黄脉病毒。

表2 系统进化分析用到的病毒种类及同源性分析

图5 基于ClYVV全基因组序列构建的系统发育树

2.5 ClYVV江苏蚕豆分离物基因序列分析

ClYYV全基因组序列聚类分析的结果表明，ClYVV-JS与除德国NGSTPS18(MW848532)分离物外的9个分离物聚于一支，进一步将ClYVV-JS基因组的11个基因序列与这9个分离物进行比对分析。结果(表3)显示：P1的核苷酸序列与已报道的ClYVV分离物同源性为89.64%～96.91%，与日本No.30分离物(AB011819)同源性最高；HC-Pro的核苷酸序列同源性为93.95%～97.16%，与美国Ca分离物(MW287328)同源性最高；P3的核苷酸序列同源性为93.20%～96.84%，与美国IA-2016分离物(MK292120)同源性最高；P3N-PIPO的核苷酸序列同源性为92.63%～97.69%，与日本90-1 Br2分离物(AB732962)同源性最高；6K1的核苷酸序列同源性为89.31%～95.57%，与中国合肥ClYVV分离物(KU922565)同源性最高；CI的核苷酸序列同源性为91.08%～96.38%，与日本No.30分离物(AB011819)同源性最高；6K2的核苷酸序列同源性为90.57%～97.48%，与韩国BH分离物、美国IA-2016分离物(LC643587、MK292120)同源性最高；VPg的核苷酸序列同源性为96.51%～97.91%，与日本No.30分离物、日本90-1 Br2分离物(AB011819、AB732962)同源性最高；NIa-Pro的核苷酸序列同源性为96.71%～98.49%，与日本I89-1分离物(LC096082)同源性最高；NIb的核苷酸序列同源性为97.24%～98.46%，与日本No.30分离物(AB011819)同源性最高；CP核苷酸序列同源性为94.96%～97.41%，与日本No.30分离物(AB011819)同源性最高(表3)。这些结果说明，在ClYVV的11个基因中，VPg、NIa-Pro和NIb这3个基因相较于其他基因变异相对较少，可能相对比较保守。

表3 ClYVV-JS与其他ClYVV分离物基因的同源性分析

3 讨论

本研究对2018年江苏省蚕豆病毒病调查过程中采集的蚕豆疑似病样进行病毒检测时发现，盐城局部蚕豆田块存在ClYVV的侵染危害；进而通过分段克隆获得ClYVV-JS全基因组序列，明确了其基因组结构特征。系统聚类分析结果显示，该分离物属于ClYVV的一个病毒株系，其与日本分离物(AB011819)[18]核苷酸序列同源性最高，达96.37%，氨基酸序列同源性达99.06%，而与中国安徽分离物(KU922565)[15]核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为94.74%和98.44%。虽然江苏与安徽在地域上相对较近，但两个分离物并未表现出最高的同源性，这个结果说明中国ClYVV的群体结构比较复杂，江苏的ClYVV侵染源可能不是临近的安徽。

马铃薯Y病毒属是植物病毒最大的一个属，能侵染多种单子叶和双子叶植物，在全世界范围造成巨大危害[19-20]。三叶草黄脉病毒作为其中重要成员，可侵染白三叶草[21]、蚕豆、豌豆、豇豆及多种豆科作物。生产中，ClYVV可以通过蚜虫广泛传播，严重影响侵染对象的产量和品质，该病毒病在世界多个国家均有发生。

中国蚕豆种植面积位居世界首位，江苏是中国传统的蚕豆种植省份，常年种植面积达1.333×105hm2左右[22]。但目前针对蚕豆上的病毒病研究相对较少。2018年，在盐城、南通、泰州等地蚕豆调查中发现，ClYVV广泛存在于蚕豆生产中，重发田块发病率达50%～60%。由于该病毒寄主范围较广，易通过蚜虫或汁液机械传毒至其他寄主植物，存在潜在流行危害风险。因此，生产中应当密切关注该病毒病的发生，做好病毒的早期监测和预警，适时控制传毒介体蚜虫，切断传毒途径，控制该病毒病发生与扩散，减少损失。