辣椒应答冷信号转导机制研究进展

潘宝贵 钱恒彦 戈伟 刘金兵 郭广君 刁卫平 王述彬

摘要：辣椒原产中南美洲热带地区，为喜温性蔬菜作物。冷害是辣椒生产中的主要逆境因子，严重影响辣椒的生长发育。遭受冷害胁迫时，包括辣椒在内的众多植物通过多个信号转导途径调节耐冷相关基因的表达，提高植物的耐冷性。本文从冷信号感知、冷信号转导途径中关键转录因子、耐冷基因表达等方面，综述了辣椒应答冷信号的研究进展，从而为辣椒耐冷分子机制研究提供参考。

关键词：辣椒;冷害;信号转导;转录因子;耐冷基因

中图分类号：S641.3

文献标识码：A

文章编号： 1000-4440（2019）03 -0743 -06

辣椒（Capsicum spp.）原产中南美洲热带地区，属于喜温性蔬菜作物，冷害胁迫对辣椒生长发育会造成不利的影响。低于15℃低温条件下，辣椒种子萌发时间延长，发芽率下降，幼苗叶片萎蔫，株高、茎粗、叶长、叶宽等生长指标逐渐减小，花器发育不良，产量下降，直至植株倒伏、死亡[1-5]。中国辣椒种植面积1.5x10～ 2.Ox10 hm，主要分布于北方保护地种植区、北方露地种植区、南菜北运基地、高山种植区、夏菜基地和华中露地种植区等6个区域[6-7]。近年来，冬春季气候变化异常，雨雪、倒春寒频发等冷害天气严重影响了辣椒生产的效益。选用耐冷品种是缓减冷害的经济有效措施。辣椒育种研究者常将耐冷育种作为抗逆育种的主攻目标，已经选育出一批耐低温辣椒品种，例如苏椒1614适合长江流域冬春季保护地栽培，胜寒740适合北方保护地早春茬种植[8]，中椒106号适合高山种植区栽培[6]。

对冷信号感知、冷信号转导、下游基因表达等的研究结果表明，植物通过复杂的冷信号转导途径提高耐冷性。其中研究得较为清晰的为ICE-CBF-COR途径：植物通过细胞膜感知低温信号，细胞内Ca2+浓度发生改变，bHLH型转录因子ICEI（ Inducer of CBFExpression l）激活，通过顺式作用元件调控CBF（C—repeat binding factor）表达，与冷调节（Cold-regulated，COR）基因启动子CRT/DRE元件特异结合，启动COR基因的表达，植物的耐冷性提高[9-12]。在辣椒耐冷机制研究方面，钙离子（Ca2+）、脱落酸（ ABA）、活性氧清除物质、渗透调节物质等在辣椒冷信号转导途径中的作用越来越明晰，特别是2014年辣椒全基因组数据的公布，辣椒耐冷相关转录因子CBF、WRKY、NAC、MYB及冷响应基因的分子机制研究受到普遍关注。本文据此综述辣椒冷信号感知、信号转导途径中的关键转录因子、冷调节基因等方面的研究进展，为辣椒耐冷分子机制研究及耐冷新种质创制提供参考。

1 辣椒对冷信号的感知

1.1 通过Ca2+感知冷信号

植物通过多个温度感受器感知温度信号，尽管相关分子机制尚不明确，但Ca2+在维持细胞膜结构稳定，延缓膜损伤中起重要作用13]。最新研究结果表明，植物可能通过跨膜结构蛋白COLDI（ chilling-tol-erance divergence l）感知冷信号。水稻质膜上跨膜结构蛋白COLDI，通过三亚基G蛋白来调节细胞内第二信使Ca2+浓度的变化[14]，细胞内Ca2+浓度升高，激活钙调蛋白（ CaM），形成钙信号（Ca2+/CaM）系统，调节冷调节基因的表达[15]。在辣椒研究上，用10 mmolCa2+浸种或直接处理辣椒幼苗叶片，在5℃低温胁迫下，辣椒幼苗叶片中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（ POD）等保护酶活性提高，可溶性蛋白质、可溶性糖等保护性物质含量增加，电解质渗透率和丙二醛（MDA）含量降低，辣椒耐冷性提高[16-17]。采用CaM抑制剂W7[Ⅳ_（6一氨基己基）-5-氯-1-萘磺胺]浸种处理后，低温胁迫下辣椒幼苗叶片中可溶性蛋白质、可溶性糖、脯氨酸（ Pro）含量下降[18];

1.2 通过脱落酸感知冷信号

越来越多的研究结果证实，脱落酸（ ABA）、茉莉酸、水杨酸、赤霉素、油菜素内酯、细胞分裂素等植物激素参与了植物冷信号转导，其中ABA的作用尤为重要。植物遭受低温胁迫后，体内ABA大量积累，与ABA受体蛋白PYR/PYL/RCAR结合形成蛋白复合体，结合蛋白磷酸酶2C（ Type 2C proteinphosphatase，PP2C），蛋白激酶OST1（Open stomata1）活性被激活，OST1通過与CBF上游的转录因子ICE1互作并磷酸化ICEI，从而增加ICEI在低温条件下的稳定性和转录活性，最终导致植物抗冻能力增强[19-20]。辣椒低温胁迫处理研究结果表明：低温促进了辣椒叶片中ABA的合成[21];低温处理中施用外源ABA后，辣椒幼苗中片MDA含量、相对电导率降低，超氧化物歧化酶（ SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）等抗氧化酶活性增加，脯氨酸（ Pro）、可溶性蛋白质、可溶性糖含量提高，辣椒幼苗耐冷性提高[22-24]。

2 冷信号转导途径中的关键转录因子

2.1 AP2/ERF转录因子

AP2/ERF转录因子是植物特有的一大类转录因子，通过与下游基因启动子区域的CRT/DRE（C—repeat/drought-responsive element， A/GCCGAC）或GCC-box（ AGCCGCC）等顺式作用元件结合调节下游基因的表达。AP2/ERF转录因子分为AP2、DREB（ DRE-binding protein）、RAV（ RelatedtoABI3/VPl）和ERF等4个亚家族，DREB亚家族又分为6个亚组（A-I至A-6），其中A-I亚组（C-repeat binding factor/DRE binding factor 1，CBF/DREBI）转录因子在植物冷信号应答过程中起着关键调控作用。

在拟南芥中，有3个CBF成员参与冷响应，分别为CBF1、CBF2和CBF3[25-27]，在植物冷信号应答中发挥着重要作用;CBF1、CBF3基因的超量表达也能够提高作物对干旱、高温的耐受性[28-29];拟南芥CBF4基因不受低温诱导[30]，但将拟南芥CBF4基因转入辣椒后，经过15℃低温处理的转基因植株表现为株型紧凑、叶片肥厚平直、叶色浓绿、叶面积增大、SOD和POD活性提高[31]。

辣椒中已经鉴定出3个参与冷响应的CBF成员，分别为CaCBFla（AY368482）、CaCBFlb（ AY368483）和CfCBF3（HM748942）。辣椒CaCbFla、CaCbFlb和CfCBF3受低溫胁迫诱导产生，且在长期低温胁迫条件下持续表达，但当恢复到25℃时，CaCbFla和CaCbFlb的转录水平在40 min内显著下降[32-33]。在烟草中过表达CfCBF3，可导致转基因植株中总不饱和脂肪酸的增加，从而减轻低温胁迫对植株的损伤[33]。研究结果表明，CaCbFla、CaCbFlb和CfCBF3均通过非ABA依赖途径参与辣椒的冷响应[32-33]。辣椒Ca-DREB’/P/受干旱和盐害诱导，但不受冷胁迫诱导[34]，其蛋白质序列与CaCBFIB的相似度为99.53%，仅在第145位上有1个氨基酸残基的差异，其与CaCBFIB对冷信号应答的差异需要深入研究。

2.2 WRKY转录因子

WRKY转录因子至少含有一个与DNA结合的WRKY结构域，该结构域由60个氨基酸组成，其N端含有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列。WRKY蛋白通过与启动子区域的W-box（ ITGACT/C）结合来调节靶标基因的表达。拟南芥WRKY家族包含74个成员[35]，WRKY34受低温诱导后在成熟花粉粒中特异表达，wrky34突变体的花粉粒存活率及CBF的表达量都高于野生型，表明存在WRKY34负调控CBF介导的低温应答途径[36]。

辣椒WRKY家族包含71个成员，根据WRKY结构域的数量及锌指结构特征分为Group I、GroupII和Group III三类[37]。辣椒CaWRKY1定位于细胞核中，其表达水平在低温胁迫（4 ℃）下持续增加，同时还受ABA（ 100μLmol/L）、盐害（150 mmol/LNaCl）、干旱（150 mmol/L甘露醇）诱导;在马铃薯中异源表达CaWRKY1，使转基因植株抗旱性增强，同时诱导转基因植株叶片中CBF3、锌指蛋白ZATlO、海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）和晚期胚胎发生丰富蛋白（ LEA）的表达[38]。冷害胁迫下，Ca WRKYIA在短期内（3 h）即可被强烈诱导，在24 h达到峰值，同时受盐胁迫和ABA胁迫上调，Ca WRKYIA转基因烟草植株的耐冷性显著提高[39]。

2.3 NAC转录因子

NAC（NAM、ATAFl/2和CUC2）转录因子是植物特有的一类转录因子，N端具有一个保守的约150个氨基酸组成的NAC结构域，含有A、B、C、D和E五个亚结构域，C端为转录激活区，具有高度的多样性。拟南芥和水稻NAC家族分别包含105个和75个成员，根据预测蛋白质序列的相似性分为I和II两个大组[40]。拟南芥花粉受低温胁迫（4℃，48 h）处理后，萌发率下降到39. 2%，其中5个NAC基因表达上调，6个NAC基因表达下调[41]。过量表达SINAC1的转基因番茄植株保持较高水平的PSII最大光化学效率（Fy/Fm）和放氧活性，比野生型植株具有更好的耐冷性[42]。在烟草中过量表达番茄SINAM1，转基因植株内NtDREB1、NtP5CS和NtERDlOs等与胁迫相关的基因表达上调，植株的低温耐受性增加[43]。

辣椒NAC基因家族包括104个成员，其中CaNAC72和CaNAC27分别与参与多个胁迫响应的拟南芥ANAC055和马铃薯StNAC30同源，可被盐害（300 mmol/L NaCl）、干旱（400 mmol/L甘露醇）等诱导，同时可被ABA和茉莉酸甲酯（MejA）诱导[44]。辣椒CaNAC2定位于细胞核并具有转录激活活性，辣椒P70幼苗叶片中CaNAC2在低温胁迫（4℃，48 h）下表达水平持续增加，TRV2-CaNAC2病毒诱导的基因沉默（ VIGS）幼苗植株的冷敏感性增加，CaNAC2同时受盐害和ABA强烈诱导[45]。

2.4 MYB转录因子

MYB（ V-myb avian myeloblastosis viral oncogenehomolog）转录因子在植物中普遍存在，根据不完全序列重复（R）结构数量，分为IR-MYB/MYB-related、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB四个亚类[46]。植物MYB基因的数量较多，拟南芥中已经发现196个MYB基因，水稻中有185个[47]。拟南芥MYB15属于R2R3-Myb家族，在冷胁迫下表达上调，MYBY15与ICE1相互作用，与CBF基因启动子中的Myb识别序列结合;研究结果表明MYB15是一个负调节因子，MYB15的过度表达导致CBF基因的表达减少，植物的耐低温能力下降[48]。辣椒CaMYB同样为R2R3-MYB类型，CaMYB的表达受盐害、干旱、冷害和ABA的诱导，早期还受H202诱导[49]。

3 冷信号下游基因的表达

3.1 冷调节基因的表达

COR基因是一类在低温下快速表达的植物抗寒基因，在启动子区域含有顺式作用元件DRE/CRT，CBF通过DRE/CRT启动COR基因的表达，在植物应答冷信号中有着重要作用。拟南中COR基因包括COR6.6、COR15a、COR78、COR47 （ LEA II）、HVA1（LEAⅢ）等多个家族[50]。拟南芥COR15a编码的成熟肽作用于叶绿体的基粒，能降低由结冰造成的脱水作用对膜的伤害[51]。过量表达COR15a可以提高未经低温驯化的拟南芥叶绿体的耐冻性[52]。

DHN属于胚胎发育晚期丰富蛋白（Late embry-ogenesis-abundant proteins，LEA）第2组。已经鉴定出7个辣椒CaDHN基因，根据保守结构域分为Yn-SKn和SKn两种类型，具有DHN家族特有的保守性K结构域和S结构域，受冷害胁迫诱导表达。利用VIGS方法研究发现CaDHNI和CaDHN3功能缺失植株对冷害耐受性降低，CaDHN1不能被ABA诱导，CaDHN3可被ABA诱导表达[53-54]，说明CaDHN1和CaDHN3尽管为同一基因家族，但通过不同途径应答低温信号。

3.2 活性氧清除系統基因的表达

在低温胁迫环境下，植物通过抗氧化酶和抗氧化物清除细胞内的过量活性氧（ ROS），从而避免对植物细胞生物分子产生有害影响。抗氧化酶主要有SOD、CAT、APX等，抗氧化物主要有Pro、谷胱甘肽（ GSH）、抗坏血酸（Vc）等[55]。低温条件下，辣椒体内Vc和GSH含量上升且维持较高的水平，CAT、APX、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDAR）和谷胱甘肽还原酶（GR）活性上升，SOD（ Mn-SOD、FeSOD、CUZnSOD）基因的表达水平未发生明显变化[56]。

3.3 渗透调节物质基因的表达

海藻糖（Trehalose）是一种重要的渗透调节物质。植物体内海藻糖主要经TPS/TPP途径合成，其中TPS（海藻糖-6-磷酸合成酶）、TPP（海藻糖-6-磷酸磷酸酶）是合成途径中的关键酶。低温处理后，辣椒Ca TPS1基因在叶片中大量表达[57]。利用外源0.5 mmol/L海藻糖浸种，可以提高辣椒种子低温（15 ℃）条件下的发芽势和发芽率[58]。研究结果表明，海藻糖通过降低细胞膜透性和MDA含量提高辣椒抗寒性，通过提高抗氧化酶活性和减少超微结构损伤而提高辣椒采后果实的耐冷性[59]。对水稻的研究结果表明，MAPK3磷酸化并维持ICE1的稳定，促进了TPP1转录，诱导大量海藻糖产生，从而增强水稻的抗冷能力[60]。这进一步说明植物可以通过多种机制或网络应答低温信号。

4 研究展望

现有辣椒耐冷机制研究中，缺少普遍认可的耐冷材料，研究人员多采用杂交一代品种作为试验材料，由于遗传背景复杂，限制了耐冷基因的发掘和耐冷机制的深入研究。后续研究需要广泛搜集辣椒种质资源，特别是不同生态地区的辣椒材料，鉴定筛选出苗期与成株期耐冷性一致的辣椒材料，用于辣椒耐冷材料的创制及耐冷机制的深入研究。这方面的探索研究已有报道，例如起源于土耳其的辣椒材料20805在低温弱光下表现出更好的弱光利用能力和更高的光化学效率[61]，利用耐冷野生甜椒CA157和栽培甜椒CA52创制出耐冷渐渗系CL122[62]。

植物耐冷性由多基因控制，且受AP2/ERF、MYB、WRKY等多个转录因子调控。在辣椒耐冷性相关转录因子研究方面，只有CBF、WRKY、NAC、MYB等部分转录因子的表达与功能研究，对其在辣椒冷胁迫响应分子机制的研究还十分有限。未来应通过深入研究CaCbF1、CaWRKY1、CaNAC2、CaMYB等转录因子的分子机制，筛选冷信号转导网络中的关键因子，从而进一步完善辣椒应答冷信号转导途径。

在水稻中，已经获得256个耐冷性相关的QTL，其中发芽期70个，芽期29个，苗期98个，生殖生长期59个[63]。这也说明植物耐冷性是受多个基因控制的复杂性状，可能在同一个发育时期耐冷性受多个耐冷QTL控制，在不同发育时期则分别受不同耐冷QTL控制。在辣椒温度敏感相关QTL定位研究中，以温度敏感突变体C，chinense cv. sy-2（低于20oC即表现为皱叶）为材料，在l号染色体定位到1个QTL，获得2个候选基因ORFlO和ORF20，预测编码F-box蛋白[64]。在辣椒实际生产中，冷害对辣椒成株期产量形成的影响要大于对苗期的影响，辣椒发芽期、苗期、特别是成株期耐冷性相关QTL定位及相关基因的发掘需要深入研究。

辣椒有5个栽培种和22个野生种[65]。生产用商业品种育种材料主要来源于一年生种（C.annu-um），遗传背景狭窄，因此应加大辣椒种间杂交、胚拯救等技术的研究，发掘利用其他栽培种和野生种中的耐冷基因。辣椒属于组织培养顽拗型植物，目前仍缺乏高效的遗传转化体系，且遗传转化效率严重依赖于基因型，研究者应加大非组织培养遗传转化方法的研究力度，以用于冷信号转导中关键基因的功能验证。CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术正在快速发展，已经在拟南芥、烟草、大豆、番茄、马铃薯、水稻、小麦、玉米等作物中得到应用。在辣椒研究中应用基因组编辑技术，将对辣椒耐冷材料创制和冷信号应答机制研究十分有利，对辣椒育种工作同样具有重要意义。

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（责任编辑：张震林）