玉米尾孢菌灰斑病抗性种质鉴定及其抗性基因分析

谭静 罗吉 王文瑞 王琨 高佳琪

摘要：灰斑病是全球玉米的重要病害，特別对中国西南地区玉米的生产造成了严重影响，玉米尾孢菌是中国西南地区玉米灰斑病的主要致病菌种。本研究采用来源广泛的241份玉米自交系构建关联群体，在云南玉米灰斑病重病区进行灰斑病的田间自然发病抗性鉴定;利用覆盖玉米全基因组的单核苷酸多态性（SNP）标记对由241份玉米自交系构建的关联群体进行基因型分析，在此基础上通过全基因组关联分析进行玉米灰斑病抗性基因的定位及其候选基因的预测，为玉米灰斑病抗性育种提供技术支撑。2017-2018年的玉米灰斑病抗性鉴定结果显示，2年共有109份热带/亚热带玉米自交系之间和109份温带玉米自交系材料之间以及材料与年份互作间的差异均达极显著水平;在2017-2018年的抗性鉴定结果中均表现为抗病的材料有44份，均表现为高抗的材料仅有5份。用20 586个高质量SNP标记、2年玉米灰斑病表型数据进行全基因组关联分析，结果显示，在P≤0.001（-lgP≥3）条件下，共检测到44个与玉米灰斑病抗性显著关联的SNP位点，其中34个SNP位点对应31个基因，分布在除10号染色体外的其他染色体上。结合已有的连锁定位研究结果可知，在以上31个基因中，除了4个基因外，其余27个基因均分布在已知数量性状座位（QTL）区间内，将这27个基因在生物信息数据库中与已有信息进行比对，共获得8个与抗病相关的候选基因。研究结果可为由玉米尾孢菌引起的玉米灰斑病的抗性育种及其抗性基因的克隆、抗病机制的研究奠定基础。

关键词：玉米;玉米尾孢菌;灰斑病;抗性种质;抗病基因;关联分析

中图分类号：S435.131.4+9文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）06-1373-09

Abstract： Gray leaf spot （GLS） is an important disease of maize in the globe， which brings about severe impact on maize production especially in Southwestern China. Cercospora zeina is the main pathogen of GLS in Southwestern China. In this study， 241 maize inbred lines with wide sources were used to construct association population， and the resistance phenotype to GLS under natural condition in the severe disease area of Yunnan was evaluated. Genotypes of the association population constructed by 241 maize inbred lines were analyzed by single nucleotide polymorphism （SNP） markers covering the whole genome. Then the loci of GLS-resistant genes and the candidate genes were predicted to provide technical support for the GLS-resistant breeding of maize by genome-wide association analysis. The two-year （2017 to 2018） identification results of GLS-resistance indicated that there were significant differences among 109 tropical/subtropical maize inbred lines， 109 temperate maize inbred lines and the interaction between materials and years. There were 44 inbred lines with disease resistance and five inbred lines with high resistance in two years of resistant evaluation. The results of genome-wide association analysis by using 20 586 high-quality SNP markers and two-year phenotypic data of GLS indicated that， under the condition of P≤0.001 （-lgP≥3）， a total of 44 SNP loci significantly associated with GLS-resistance were detected， among which 34 SNP loci corresponding to 31 genes were distributed on chromosomes except for chromosome 10. Compared with existing research results on linkage location， it could be seen that except for four genes， the remaining 27 genes of the 31 genes were located in the quantitative trait locus （QTL）. Eight candidate genes related to diseaseresistance were obtained by comparing the 27 genes in bioinformatics database. The results will lay a foundation for the resistance breeding， the cloning of resistant genes and the resistance mechanism research on maize GLS （Cercospora zeina）.

Key words：maize;Cercospora zeina;gray leaf spot;resistant germplasm;resistant gene;correlation analysis

玉米（Zea Mays L.）是全球第一大粮食作物，灰斑病是玉米叶部的主要病害，在世界各玉米产区均有发生，一般会造成玉米产量损失达5%～30%，严重时可达60%以上，甚至造成绝收[1-4]。在中国西南高海拔玉米种植区，灰斑病已经成为玉米生产中最重要的病害，在云南地区已经超过玉米大斑病成为玉米生产中的第一大病害[2， 5-6]。长期以来，国内研究者一致认为，玉蜀黍尾孢菌是中国玉米灰斑病的致病菌种[7]，直到2013年才有报道指出，玉米尾孢菌是中国西南地区玉米灰斑病的主要致病菌种[8-9]。

培育和种植抗病品种是控制植物病害最经济有效的途径，而抗病育种的成效取决于对获得抗原、抗病遗传机制的认识。目前，国内外研究者已经开展了大量玉米灰斑病的抗源筛选工作，虽然有研究结果表明，玉米自交系、杂交种对灰斑病的抗性差异明显，但均未发现对灰斑病免疫的玉米种质，大多数玉米种质对灰斑病表现为感病[3，10-12]。多数研究发现，玉米对灰斑病的抗性主要表现为加性遗传效应，属于数量性状遗传效应[13-14]。研究者已经用不同群体定位了多个抗玉米灰斑病QTL，这些QTL在玉米的10条染色体上均有分布[15-24]。但是这些研究大多是针对玉蜀黍尾孢菌玉米灰斑病的抗性，加上受连锁分析自身的局限，不能全面挖掘玉米灰斑病抗性基因，且多数定位精度不高，难以在玉米灰斑病的抗性育种中得以应用。

关联分析是一种以连锁不平衡为基础，鉴定与表型变异紧密联系的功能性等位基因/基因型的分析方法。具有研究周期短、分辨率高、可同时检测数十个基因等优点，是复杂数量性状基因挖掘和验证的首选方法[25-27]。Mammadov等[28]结合连锁和关联分析法，在玉米第1、6、7、8号染色体上获得了抗玉米灰斑病QTL;Kuki等[29]通过全基因组关联分析检测到7个单核苷酸多态性（SNP）位点与玉米灰斑病抗性显著相关，并发现3个抗玉米灰斑病的候选基因。本研究利用自然发病原理对241份来源广泛的玉米自交系进行玉米尾孢菌灰斑病抗性鉴定，为西南地区玉米抗灰斑病育种提供材料支撑。同时，本研究利用覆盖全基因组的SNP标记，通过全基因组关联分析全面挖掘抗玉米尾孢菌灰斑病的基因及其位点，并对检测到的显著性位点与前人研究得到的QTL区间进行比较，结合生物信息学分析方法，从一致性位点中预测候选基因，为玉米尾孢菌灰斑病抗性基因的克隆和抗病机制的研究奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

参考已有表型数据和系谱关系，从来源广泛的630份玉米自交系中优先选择没有直接亲缘关系、抗灰斑病差异大的241份玉米自交系构建关联群体，其中111份来自CIMMYT（国际玉米小麦改良中心），30份来自美国，6份来自泰国，其余94份来自国内不同玉米生态区，其中包括在中国玉米产业中大面积推广使用的一些重要杂交种的亲本。

1.2田间试验与抗性鉴定

利用重病区自然发病原理进行玉米灰斑病的抗性鉴定，于2017-2018年在云南保山市郊进行。根据系谱将研究材料分为热带/亚热带、温带2组，组内采用随机区组设计，设2次重复，同时选取4个典型材料（抗病自交系Y32、感病自交系Ye478、抗病杂交种海禾2号、感病杂交种会单四号）作为对照，每40行设置1组对照（含2个抗病对照材料、2个感病对照材料），在试验地外围种植2行感病材料作为保护行。种植规格参照当地习惯，加强田间水肥管理，试验期间防虫但不防病，在开花后第2周参照王晓鸣等[30]的玉米灰斑病分级标准对植株的抗病性进行鉴定，按照抗病性由强到弱分为1级、3级、5级、7级、9级（其中1级为高抗，9级为高感），以后每隔1周调查1次，共调查3次，取病级最符合正态分布的1次调查结果。每次调查均由2人进行独立评价，每个小区最终的病害级别为2人评价值的平均值。

1.3基因型鉴定

用Affymetrix SNP 56K芯片（包含56 110个SNP标记）对上述自交系进行基因型分析，对芯片检测结果进行严格的质量控制，最终选取20 586个高质量SNP标记用于后续的数据分析。

1.4数据分析

用SPSS 25.0软件对表型数据进行描述性统计和方差分析，用Structure（V 2.3.4）软件进行群体结构分析，再利用TASSEL 5.0软件中的混合线性模型（Mixed-linear model，MLM），在考虑群体结构和亲缘关系的条件下进行SNP标記与玉米灰斑病表型之间的关联分析，参照P≤0.001（-lgP≥3）的标准进行显著性位点检测，并对检测到的显著性位点与前人研究得到的QTL区间进行比较，结合生物信息学方法，预测与前人研究得到的QTL一致性位点中的候选基因。

2结果与分析

2.1抗性鉴定

由于田间出苗、生长等因素而使部分材料缺失，2017年获得了232份玉米自交系的灰斑病抗性鉴定结果，2018年获得了225份玉米自交系的灰斑病抗性鉴定结果。2017年的玉米灰斑病抗性鉴定结果显示，抗病自交系Y32的平均病级为1.50，抗病杂交种海禾2号的平均病级为2.19;感病自交系Ye478的平均病级为6.88，感病杂交种会单四号的平均病级为6.31。2018年的玉米灰斑病抗性鉴定结果显示，抗病自交系Y32的平均病级为1.00，抗病杂交种海禾2号的平均病级为3.25;感病自交系Ye478的平均病级为7.63，感病杂交种会单四号的平均病级为7.94。由此可见，在鉴定试验中抗病对照、感病对照的发病病级适宜且二者间差异明显，说明在本试验条件下得出的玉米灰斑病发病程度和鉴定效果可以用来区分不同玉米材料的抗性差异。

对2017-2018年共有的218份玉米自交系的灰斑病抗性鉴定结果进行方差分析，由表1可见，材料间以及年份与材料间互作的差异均达极显著水平，说明玉米灰斑病表型与环境之间存在极显著互作，109份热带/亚热带玉米自交系和109份温带玉米自交系对玉米灰斑病的抗性均存在极显著差异。正态分布检验结果表明，2017-2018年玉米灰斑病表型的偏度、峰度绝对值均小于1，符合正态分布，2017-2018年玉米灰斑病病级的频率分布直方图见图1。

在2017年，232份玉米自交系的灰斑病病级在1.00～9.00级均有分布，平均病级为4.79级，其中高感材料（病级>7.00）37份，感病材料（5.00<病级≤7.00）63份，中抗材料（3.00<病级≤5.00）59份，抗病材料（1.00<病级≤3.00）61份，高抗材料（病级≤1.00）12份。在2018年，225份玉米自交系的灰斑病病级在1.00～9.00级均有分布，平均病级为4.96级，其中高感材料33份，感病材料61份，中抗材料55份，抗病材料57份，高抗材料19份。综合2017-2018年的玉米灰斑病抗性鉴定结果可知，2年都表现为抗病的材料有44份，2年都表现为高抗的材料有5份（分别为DTMA25、CIMBL32、CIMBL70、GEMS19、PS61-20），可以在玉米灰斑病抗病育种中应用这5份高抗材料。

2.2全基因组分析

对241份玉米自交系的群体结构分析可知，△K在K=2时出现第1个峰值（图2a、图2b），将241份玉米自交系划分成2个亚群，与系谱信息进行比对后发现，第1个亚群对应育种实践中的热带/亚热带（Tropical and subtropical， TST）种质，第2个亚群对应育种实践中的温带（Temperate， TEM）种质;△K在K=4时出现第2个峰值（图2a、图2c），说明该群体能进一步被划分为4个亚群，对应系谱中这4个亚群分别为TST群、温带坚秆（Stiff stalk）群、温带非坚秆（Non-stiff stalk）群和温带唐四平头群。

分析结果表明，在P≤0.001（-lgP≥3）条件下，2017年检测到22个与抗性显著关联的SNP位点，2018年检测到23个与抗性显著关联的SNP位点，2年均检测到的SNP位点仅有1个，对应标记为AX86259524（表2）。通过查阅注释文件发现，在2年内检测到的与玉米灰斑病抗性关联的44个SNP位点中，有10个位点的注释信息位于基因间区域，其余34个有注释信息的SNP位点共对应31个基因，这31个基因分布在除10号染色体外的其他染色体上，其中分布在6号染色体上的基因数最多，有6个，分布在4号染色体上的基因数最少，仅有1个，分布在其余染色体上的基因数为2～4个。

2.3抗性基因与已知抗性QTL比较

将本研究检测到的31个基因与前人研究确定的玉米灰斑病抗性QTL区间进行比较，发现除了位于bin 1.11的2个基因（登录号：GRMZM2G163912、GRMZM2G156543）和位于bin 2.04的1个基因（登录号：GRMZM2G161932）、位于bin 5.02的1个基因（登录号：GRMZM2G057129）外，其余27个基因均分布在前人研究的QTL区间内（表3）。虽然以上4个基因不位于前人研究的QTL区间内，但都与已定位的QTL相距不远，它们是否属于新的QTL还有待进一步研究确定。其中1号染色体上登录号为GRMZM2G163912的基因与Zhang等[20]定位的QTL区间的右标记umc1500在遗传图谱上只相距54.20 cM，与闫伟等[31]通过QTL元分析定位的QTL区间右标记ias13a的距离更近，为47.12 cM，登录号为GRMZM2G156543的基因与闫伟等[31]通过QTL元分析定位的QTL区间右标记ias13a相距99.52 cM;2号染色体上登录号为GRMZM2G161932的基因与Balint-Kurti等[18]定位的mmp167～umc2249 QTL区间的物理距离最近，为432 kb;5号染色体上登录号为GRMZM2G057129的基因与Benson等[32]定位的QTL区间右边界的物理距离只有14 kb。

3讨论

3.1玉米灰斑病抗性鉴定与抗性种质培育

准确的抗性鉴定是抗病育种及抗病基因定位的根本前提。人工培养玉米灰斑病的病原菌较难，发病要求的环境较难控制，而利用重病区的自然发病原理是玉米灰斑病抗性鉴定的有效途径[35]。本试验地点位于云南省保山市市郊（海拔1 600 m，地理坐标为25°08′N，99°10′E），属于玉米灰斑病的重灾区，当地气候温暖潮湿，田间相对湿度较高，并且土壤属微酸性红壤，有利于病原菌的存活、侵染和在田间发病流行。目前，许多有关玉米灰斑病的研究都将试验地点设在云南省保山市市郊[20-21，23]，而且已有研究发现，该地区的玉米灰斑病病原菌为玉米尾孢菌[2，8-9]。由此可见，本研究所选试验地点可以从环境、气候、病原菌等方面为玉米尾孢菌灰斑病的发生与流行提供条件，从而为本研究得到真实、可靠的表型数据提供重要保障。

为了准确评估研究材料的抗病情况，本研究在田间试验设计的基础上采用嚴格的措施控制试验误差，一是将关联群体按照热带/亚热带、温带种质分为2组，组内采用随机区组设计，2次重复;二是设置大量对照，每40行放1组对照（2个抗病对照材料，2个感病对照材料），以提高试验数据的准确性。从试验结果看，对照材料抗病自交系Y32在2017年、2018年这2年的抗性鉴定结果中表现为一致抗病，感病自交系Ye478表现为一致感病;2017年232份玉米自交系的平均病级为4.79级，2018年225份玉米自交系的平均病级为4.96级。方差分析结果显示，玉米灰斑病表型不仅在玉米材料间表现出极显著差异，在年份与材料互作间也表现出极显著差异。分析其原因，一方面由于玉米灰斑病抗性是由许多微效基因控制的数量性状，易受环境影响[13-14];另一方面，也与玉米灰斑病抗性评价标准有关。在本研究中，评价玉米灰斑病抗性采用的是中国病害鉴定通用的叶斑病病级划分标准，即根据发病叶片部位及发病面积进行分级，目前大多数玉米灰斑病研究都采用这个方法进行抗性评价[20-21，23]，该方法易于掌握和在田间实施，但是通过目测叶片发病面积进行分级可能会存在一定的主观性，要求调查者能准确识别玉米灰斑病并正确评价其病级。本研究在调查过程中采用2人独立评价的方法，再取2人评价值的平均值代表该材料的病级，以尽量避免因个人主观因素带来的表型误差。

尽管目前国内外在玉米灰斑病抗性种质鉴定方面进行了大量研究，但是大多数都是针对玉蜀黍尾孢菌灰斑病抗性种质鉴定，而且目前在世界范围内缺少抗玉米尾孢菌灰斑病的种质资源。本研究通过2年的玉米尾孢菌灰斑病抗性鉴定，筛选出44份抗病材料和5份高抗材料，可以在玉米尾孢菌灰斑病的抗性遗传改良中加以利用。对这些材料的来源进行分析发现，这些抗病材料大都来源于CIMMYT（82%）。进一步查看241份玉米自交系中所有来源于CIMMYT的材料发现，中抗及以上的材料占比达到了66.7%以上，而CIMMYT种质基本上属于热带/亚热带种质，表明来源于热带/亚热带的玉米种质对于玉米尾孢菌灰斑病普遍具有较好的抗性。吴纪昌等[10]对来源广泛的915份玉米自交系进行灰斑病抗性鉴定，发现其中的高抗材料多数是从国外引进的具有热带/亚热带血缘的材料。Shi等[36-37]通过对玉米种质进行抗性鉴定发现，在中国主要的玉米種质中，具有热带/亚热带血缘的PB种质对灰斑病的抗性表现较好。综上，今后应加强热带/亚热带玉米种质的研究和应用，培育优良的抗灰斑病玉米品种。

3.2玉米灰斑病抗性位点与候选基因预测

虽然本研究检测到的与玉米灰斑病抗性显著关联的44个SNP位点中只有1个位点在2年内均被检测到，但与他人的研究结果进行比较可以发现，本研究检测到的44个SNP位点中有34个SNP位点对应31个基因，分布在除10号染色体外的其余染色体上。由此可以推测，本研究通过关联分析得到的玉米灰斑病抗性位点是真实有效的，同时也进一步证明，玉米灰斑病抗性是由许多微效基因控制的数量性状[13-14]。本研究检测到的44个与玉米灰斑病抗性显著关联的SNP位点的表型贡献率都较低（4.72%～8.46%），其中2017年、2018年重复检测到的SNP标记AX86259524的表型贡献率分别仅为5.15%、5.40%。正是因为这些位点的表型贡献率较小、极易受外界环境的影响，因此它们被重复检验的难度较大，说明表型鉴定对于受微效基因控制的数量性状研究极为重要。

将本研究检测到的位于已知玉米灰斑病QTL区间内的27个基因在生物信息数据库中进行比对，共找到8个与植物抗病相关的基因。其中登录号为GRMZM2G163426基因（TRAM/LAG/CRN8 5基因，简称TLC5）、登录号为GRMZM2G130278基因（内腔蛋白保留受体家族蛋白编码基因）和登录号为GRMZM2G069177基因（自噬相关蛋白18编码基因）都可以通过调控细胞程序性死亡来参与植物免疫反应[38-39]。Pei等[40]研究发现，自噬相关蛋白编码基因在应对小麦白粉病的免疫反应中起着积极作用。登录号为GRMZM5G889999基因（激酶-相互作用激酶1编码基因）和登录号为GRMZM2G374309基因（富半胱氨酸受体样蛋白激酶10编码基因）都包含丝氨酸/苏氨酸激酶结构域（STK），在植物免疫系统中充当细胞表面受体并转导信号，以触发植物的先天性免疫反应[41-42]。此外，许多研究都发现，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在植物抗病方面有着重要作用[43-44]。已有的研究结果也多次将丝氨酸/苏氨酸激酶基因作为玉米灰斑病抗性的候选基因[36， 45-46]。登录号为GRMZM2G068665基因（吡咯啉-5-羧酸还原酶基因）参与植物脯氨酸合成代谢途径，而游离脯氨酸可能在胁迫耐受和渗透调节中起作用[47-48]。郭红莲等[49]研究发现，游离脯氨酸含量与玉米品种对灰斑病的抗性间呈正相关。登录号为GRMZM2G007372基因（五肽重复序列蛋白编码基因）和登录号为GRMZM2G100146基因（组蛋白脱乙酰酶HDT2基因）都通过调控基因表达进而参与到植物免疫防御过程中[50-51]，在拟南芥、水稻中都有这2个基因与抗病性相关的报道[52-53]。虽然有报道表明，以上8个基因在植物中都有抗病防御的功能，但是它们是否对玉米灰斑病具有抗性还需进行相关基因的功能验证。这8个候选基因不仅分别位于不同染色体及其区段上，其抗病机制也各不相同，并且其基因功能涉及信号转导、转录调控、物质代谢和结构蛋白功能，暗示玉米灰斑病的抗病反应是一个非常复杂的过程，可能涉及多种调控途径的相互作用，因此在研究抗玉米灰斑病的过程中，还需要挖掘更多抗性基因和抗性机制。

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