基于近红外光谱的天然牧草CNCPS组分分析与预测

杜雪燕， 王 迅， 柴沙驼， 刘书杰

(1.青海大学/青海省高原放牧家畜营养与饲料科学重点实验室/青海高原牦牛研究中心，青海 西宁 810016)

天然牧草营养直接影响放牧家畜的营养状况、生命活动和生产性能。准确获取天然牧草营养信息，对草地畜牧业生产非常重要。康奈尔净蛋白质和碳水化合物体系(CNCPS)可以将牧草的化学分析与植物细胞成分及反刍动物的消化吸收高度结合，全面深度评价天然牧草的营养价值。在国内，CNCPS已广泛应用于反刍动物常用饲料营养价值测定和评价［1-3］，并且建立了适合中国肉牛和奶牛的常用饲料组分数据库［4］，为CNCPS模型的准确预测提供基础。在天然牧草营养评价方面，艳城等［5］测定了内蒙古荒漠草原区8种牧草的CNCPS组分，表明CNCPS体系将饲料化学分析与反刍动物瘤胃消化利用情况结合在一起，使结果呈现动态指标。目前，天然牧草营养价值评价主要依靠传统的化学分析方法，检测周期长、成本高。运用高效检测技术准确、全面、快速测定天然牧草营养价值，有利于实时估测草地营养状况。

近红外光谱技术(NIRS)是现代光谱分析技术、计算机技术和现代化学计量学的高度集合体，是新兴光谱分析技术［6］，以快速、实时、无损测定的优势，广泛应用于牧草、烟草、茶叶等产品的营养成分分析［7-9］。陈龙等［10］对 NIRS 在 CNCPS 体系中的应用进行了积极探索，结果表明NIRS技术可以准确预测燕麦干草CNCPS蛋白质组分含量，为NIRS在天然牧草价值方面的应用提供了新的思路。

本试验探讨利用近红外技术测定天然牧草中CNCPS蛋白质组分和碳水化合物组分的可行性，为青海地区天然牧草营养价值数据库的建立提供数据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

试验地位于青海省河南县，是典型的高寒草甸类高 山 嵩 草 草 地。经 度 101°38'08.7″～101°38'13.8″，纬度 34°51'03.4″～34°51'18.1″，平均海拔3 570 m。该草地以高山嵩草(Kobresia pygmea)为主要优势种，次优势种有线叶嵩草(Kobresia capillifolia)、矮嵩草(Kobresia humilis)、双柱头藨草(Scripus triqueter)、异针茅(Stipa aliena)、草地早熟禾(Poa crymophila)、垂穗披碱草(Elymus nutans)等，伴生有菊科、豆科、蔷薇科等牧草，主要有毒植物为秦艽(Gentiana macrophylla Pall)、橐吾(Ligularia sibirica L.)、黄花棘豆(Oxytropis ochrocephala)等。

在牧草生长季节，按照任继周样地设置原则［11］，采集 1.0 ×1.0 m2样方牧草，齐地面刈割，挑出石子、毒杂草等不可食部分，将可食牧草自然风干，共计66份样品。所有样品粉碎，65℃烘48 h，过筛(1 mm)，装入自封袋，常温避光保存，用于化学成分测定和光谱扫描。

1.2 仪器及参数

本试验使用FOSS公司生产的DS2500近红外光谱分析仪。工作参数:波长400～2 500 nm;双检测器系统，硅检测器 (400～1 100 nm)，硫化铅检测器(1 100～2 500 nm);数据采集频率为1 s扫描2次;光谱分辨率:0.5 nm;波长准确度＜0.05 nm;定标软件为WinISIⅢ;数据采集形式为lg(1/R)。工作条件:室温25℃稳定。

每次开机扫描光谱前，仪器预热30 min。将处理好的样品装入样品杯，大约为杯容量的3/4，每个样品重复扫描6次，每次均扫描背景，将平均光谱保存为样品的最终光谱，从而消除由装样紧实度以及样品粒度不同所造成的误差。

1.3 牧草营养指标的测定

1.3.1 CNCPS组分的定义和划分 CNCPS体系以反刍动物瘤胃消化特征为基础，将牧草化学成分、植物细胞组成、瘤胃消化利用情况有机结合，从蛋白质组分和碳水化合物组分更深层次评价天然牧草营养价值。CNCPS体系将蛋白质分为3部分:非蛋白质氮、真蛋白质、不可降解粗蛋白质，分别用PA、PB、PC表示。PA在瘤胃中快速降解。真蛋白质PB，包括 PB1、PB2、PB3，PB1是可溶于缓冲液的真蛋白质，属于快速降解蛋白质;PB2是中性洗涤可溶蛋白质，属于中速降解蛋白质;PB3是酸性洗涤可溶蛋白质，属于缓慢降解蛋白质。PC是酸性洗涤不溶蛋白质，为结合蛋白质，是与木质素、单宁等结合的蛋白质。碳水化合物被分为4部分:以糖类为主的快速降解部分(CA);以淀粉和果胶为主的中速降解部分(CB1);以可利用纤维为主的慢速降解部分(CB2);以牧草细胞壁为主的不可利用纤维(CC)。

1.3.2 指标测定方法 粗蛋白质(CP)、可溶性蛋白质 (SP)含量按AOAC方法［12］测定，酸性洗涤纤维(ADF)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤木质素(ADL)含量采用Vansoest等［13］的方法测定，每份样品测定2个平行，取平均值。按照Sniffen等［14］的方法计算总碳水化合物(CHO)、非结构性碳水化合物(CNSC)、CNCPS 蛋白质组分(PA、PB1、PB2、PB3、PC)、CNCPS 碳水化合物组分(CA、CB1、CB2、CC)含量。

1.4 模型的建立与优化

样品按3∶1比例随机分为定标集(Calibration)和验证集(Validation)［15］。用 WinISIⅢ软件，采用修正偏最小二乘法(MPLS)，结合散射光谱预处理和导数、平滑数学预处理方法，用定标集样品建立模型。用马氏距离(Mahalanobis distance)和绝对偏差(Residual)分别对光谱值和化学值进行检验［16］，提高模型的准确度。同时进行交叉验证，防止模型过拟合现象。根据定标标准偏差(SEC)、交叉检验标准误差(SECV)、交叉验证决定系数(1-VR)、预测标准误差(SEP)等指标评价，确定最优模型［17］。用验证集样品对最优模型进行外部验证，评价其外部预测能力［18］。用交叉验证相对分析误差RPDCV(SD/SECV)和外部验证相对分析误差RPDP(SD/SEP)对模型进行进一步评价:RPDCV和RPDP大于3，说明定标效果良好，建立的模型可以用于实际检测;小于2.5，说明该模型难以用于实际测定;大于2.5且小于3.0，模型的预测精度有待进一步提高［19］，精度提高后模型可用于实际测定。

2 结果与分析

2.1 牧草营养成分测定结果

根据马氏距离检测结果，剔除异常样品。由常规化学分析方法和CNCPS体系蛋白质各组分计算公式，计算天然牧草各蛋白质组分含量。结果(表1)显示:定标集和验证集蛋白质各组分含量范围、平均值和标准差都比较接近，验证集样品的代表性较强;牧草中CNCPS体系蛋白质组分含量由高到低依 次 为 PB2、PA、PB3、PC、PB1，PB2含 量 最 高(36.68%)，PB1含量最低(10.07%)。

表1 天然牧草中各蛋白质组分含量Table 1 The contents of protein components in natural pasture

根据常规化学分析方法和CNCPS体系碳水化合物各组分计算公式，计算天然牧草各碳水化合物组分含量。结果(表2)显示，牧草中CNCPS体系碳水化合物组分含量由高到低依次为CB2、CC、CA、CB1。CB2含量最高，达到36.37%，CB1含量最低，为1.81%。

表2 天然牧草中碳水化合物各组分含量Table 2 The contents of carbohydrates components in natural pasture

2.2 牧草样品光谱测定结果

图1显示:牧草样品光谱响应曲线形态变化呈现2种趋势。生长期牧草中含有大量的叶绿素，因叶绿素的强吸收，在以450 nm为中心的蓝波段(a)和670 nm为中心的红波段(b)出现吸收峰;随牧草生长发育停止，叶绿素含量降低，叶绿素在蓝、红波段的吸收减少，反射增加;牧草干枯时，叶绿素更少，叶黄素和叶红素在牧草叶片光谱响应中起主导作用。760～900 nm是近红外波段，是植物的高反射区，其光谱特征主要受牧草细胞结构影响。不同牧草的色素含量、细胞结构、含水量(自由水)均不同，因此在同一波长处，光谱响应会有一定的变化范围。总之，天然牧草样品光谱在全波长范围内存在多个吸收峰，为其营养成分的定量分析提供了丰富的信息。

2.3 天然牧草CNCPS组分近红外光谱分析模型的建立与评价

通过WinISIⅢ定标软件，用修正偏最小二乘法(MPLS)及不同光谱和数学处理方法，对定标集样品建立模型，筛选最佳模型。最佳处理参数下，模型的交叉检验标准误差(SECV)最小、交叉验证决定系数(1-VR)最大。

图1 牧草样品近红外光谱图Fig.1 NIRSspectra of natural pasture

利用最佳的光谱和化学处理方法，建立最优模型。由表3可以看出，粗蛋白质(CP)的交叉验证标准误差(SECV)为0.439 3，交叉验证决定系数(1-VR)为0.989，交叉验证相对分析误差(RPDCV)为9.336;不溶蛋白质(PC)的 SECV为2.255，1-VR为0.870，RPDCV为2.913。其他蛋白质组分的1-VR均小于0.8。

由表4可以看出，碳水化合物组分NDF、ADF、CHO、CNSC 的 1-VR 分别为 0.975、0.932、0.964、0.966，RPDCV 分别为 6.353、3.758、5.306、5.521;CA 的1-VR 为0.846，RPDCV 为2.603;CB1、CB2、CC的1-VR 分别为 0.684、0.716、0.619，均小于 0.9，RPDCV 分别为1.870、1.940、1.786，均小于 2.5。

表3 蛋白质组分各指标NIRS模型参数Table 3 The parameters of protein components of NIRS models

各蛋白质组分见表1注。SNV+Detrend:标准正常化+去散射处理;1，4，4，1:一阶导数处理，数据间隔点为4，平滑处理间隔点为4，二次平滑处理间隔点为1;2，4，4，1:二阶导数处理，数据间隔点为4，平滑处理间隔点为4，二次平滑处理间隔点为1;None:无散射处理。SEC:定标标准偏差;SECV:交叉验证标准误差;1-VR:交叉验证决定系数;RPDCV:交叉验证相对分析误差(RPDCV=SD/SECV)。

表4 碳水化合物组分各指标NIRS模型参数Table 4 The parameters of carbohydrates components of NIRS models

各碳水化合物组分见表2注。最佳处理参数和模型参数等见表3注。

2.4 天然牧草CNCPS组分模型预测效果分析

通过预测标准误差(SEP)、预测值与化学值的相关系数(RSQ)、外部验证相对分析误差(RPDP)，用验证集样品对模型进行外部验证，评价实际预测效果，进一步检验其优劣。对验证集样品的预测值和化学值进行成对数据双尾t检验［20］，用预测值和化学值作散点比较两者相关性。

蛋白质组分各指标模型预测效果见表5。粗蛋白质(CP)的 RPDP为10.95，大于3;其他指标的RPDP均小于2.5。各指标化学分析值与NIRS预测值相关性散点图见图 2，PA、PB1、PB2、PB3、PC 的化学分析值与NIRS预测值相关系数分别为0.82、0.67、0.80、0.64、0.86。

表5 蛋白质组分定标模型评价Table 5 The evaluation of calibration model for protein components

各蛋白质组分见表1注。SEP:预测标准误差;RSQ:NIRS预测值与实测值的相关系数;RPDP:外部验证相对分析误差(RPDP=SD/SEP)。

图2 蛋白质组分的化学分析值与NIRS预测值的相关性Fig.2 Correlation between measured and NIRS predicted values of protein components

碳水化合物组分各指标模型预测效果见表6。NDF、ADF、CHO、CNSC 的 RPDP 分别为 5.286、3.787、4.589、4.928，均大于 3;CA、CB1、CB2、CC 的RPDP 分别为 2.138、2.037、1.940、1.464，均小于2.5;CA、CB1、CB2、CC 的化学分析值与 NIRS 预测值的相关系数分别为 0.89、0.93、0.85、0.68。化学分析值与NIRS预测值相关性见图3。

表6 碳水化合物组分定标模型评价Table 6 The evaluation of calibration model for carbohydrates components

各碳水化合物组分见表2注。SEP:预测标准误差;RSQ:NIRS预测值与实测值的相关系数;RPDP:外部验证相对分析误差(RPDP=SD/SEP)。

图3 碳水化合物组分的化学分析值与NIRS预测值相关性分析Fig.3 Correlation between measured and NIRS predicted values of carbohydrates components

3 讨论

3.1 近红外光谱技术对天然牧草常规营养成分的预测

NIRS在牧草营养分析方面的应用起步较晚，但是营养成分分析是NIRS技术的传统应用领域，国内外学者对牧草、秸秆类粗饲料中营养成分进行了大量研究，建立了NIRS预测模型。Arminda等［21］建立的多花黑麦草(Lolium multiflorum)的CP、NDF、ADF、CF(粗纤维)、ASH(粗灰分)含量预测模型，定标决定系数均在0.9以上。Dale等［22］利用NIRS建立紫花苜蓿的CF、NDF、ADF、ADL含量预测模型，预测标准误差(SEP)分别为1.058、0.964、1.041、1.209。石丹等［23］首次建立了适合中国北方不同区域、不同生育期、不同干燥方式的羊草干草CP、NDF、ADF的NIRS预测模型，预测值与化学分析值的相关系数分别为0.963 7、0.959 4、0.947 9。

本研究建立了天然牧草中蛋白质组分和碳水化合物组分的NIRS模型。其中，CP的1-VR为0.989，RPDCV(9.336)和RPDP(10.95)均大于3;NDF、ADF、CHO、CNSC 含量模型的1-VR 值分别为0.975、0.932、0.964、0.966，RPDCV 值和 RPDP 值均大于 3。SP的 1-VR值为 0.717，比 Carmen等［24］报道的结果好，说明利用NIRS分析技术对该成分进行定量分析是可行的，但其预测精度有待于进一步提高。ADL的1-VR值(0.710)比较低，模型需要进一步优化。

3.2 近红外光谱技术对天然牧草CNCPS组分的预测

建立天然牧草中CNCPS组分校正模型的难度很大。其原因有:①测定指标多。CNCPS体系通过测定常规蛋白质、碳水化合物等23个指标，区分了非蛋白质氮与真蛋白质、结构性碳水化合物与非结构性碳水化合物，真实地反映饲料的特性及动物对其利用情况，能够全面反映饲料的营养成分。②计算步骤繁杂，难免误差累积。例如，通过NPN、SP、ADIP和NDIP等的测定值计算PA、PB1、PB2、PB3、PC 含量，计算结果难免会受测定值准确度的影响。NPN、SP、ADIP和 NDIP等的测定比较繁琐，ADIP的测定又受到ADF的影响，误差随测定步骤的增加而积累，并通过CNCPS的计算公式而扩大。

本试验中 CNCPS蛋白质组分 PA、PB1、PB2、PB3、PC的模型预测值与化学分析值的相关系数分 别 为 0.821、0.674、0.798、0.635、0.862，Carmen等［24］的试验结果依次为 0.467、0.054、0.051、0.734、0.747，相 比 较 可 知，本 研 究CNCPS蛋白质组分预测模型精度较好，但是比陈龙等［10］的结果差。可能是样品的原因，本试验选用的样品为天然牧草，与单种牧草的模型相比较，天然牧草样品中各营养成分的组成和含量更加复杂，对光谱数据和化学分析值的影响较大。CNCPS体系中将碳水化合物分为快速降解糖(CA)、中速降解淀粉(CB1)、慢速降解有效细胞壁部分(CB2)、不可利用的细胞壁部分(CC)。各组分的计算结果会受其他组分的交叉影响，一种组分的分析误差都会影响其他指标，甚至导致误差累积。可见，准确的化学值测定是指标模型建立的基础。Chen等［25］研究结果表明，添加新样品到定标集可以提高模型精度。因此可尝试添加样品量、提高实测值精度来优化模型。

本试验以青海省河南县典型的高山嵩草草地天然牧草为研究对象，探讨NIRS定量分析天然牧草CNCPS营养成分的可行性。采用改进偏最小二乘法，建立了天然牧草常规蛋白质组分和碳水化合物组分及CNCPS体系各组分的近红外定量分析模型。模型预测效果表明，常规组分CP、NDF、ADF、CHO、CNSC、PC、CA 含量预测模型可以实际应用。

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