利用酶联免疫反应鉴定梨树S基因型

王春雷， 高季平， 赵宪坤

(扬州大学园艺与植物保护学院，江苏 扬州 225009)

梨是典型的自交不亲和性果树，生产上通常需要配置花期一致、S基因型不同的品种作为授粉树。目前，常见梨树品种的S基因型大多被鉴定。但在生产和育种工作中梨树品种S基因型鉴定仍然必不可少。比如，育种获得的梨树新品种及新发现的地方品种，这些品种的S基因型就需要鉴定。

蔷薇科李属果树S基因型可以通过SFB序列或者S-RNase序列确定。但与李属植物不同，梨属花粉S基因至今还没有确定。因此，梨属植物的S基因型只能根据S-RNase序列判断。梨属S基因具有5个保守区域，分别是C1区、C2区、C3区、C5区以及蔷薇科植物特有的RC4区，此外还有一个高变区:RHV区。根据S-RNase基因结构特点，开发出大量以PCR技术为基础的果树S基因型鉴定法，最常用的是PCR电泳法。但是此方法有一些弊端，例如该方法很难区分长度相似的S等位基因［1-2］，利用半自动测序仪虽然能精确确定PCR产物大小，但是这种半自动测序仪价格昂贵，不适合推广［1-3］，圆点杂交也是利用探针检测PCR产物，但是圆点杂交操作难度大，测试周期长［4］。

PCR-酶联免疫分析技术开发于上世纪80年代，主要用于诊断植物病害和人类疾病［5-7］，也可以用来检测单核苷酸多态性 。在该方法中，PCR产物的序列通过探针杂交来检测，并通过免疫反应来检测探针是否与PCR产物结合。本研究拟建立一种基于PCR-酶联免疫反应鉴定梨树S基因型的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用8个日本砂梨品种采自扬州大学园艺场，品种名和其S基因型分别为爱宕(S2S5)，爱甘水(S4S5)，二十世纪(S2S4)，丰水(S3S5)，今村秋(S1S6)，秋荣(S4smS5)，新高(S3S9)和幸水(S4S5)。这些品种包含7个等位基因和1个等位基因的突变体。采集各品种花前1～2 d的花蕾收集花柱，每20朵花的花柱存于1个1.5 ml离心管中，贮于－70℃冰箱中备用。

表1 探针和引物序列Table 1 The sequences of probes and primers

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA制备 从－70℃冰箱中取出花柱，花柱总RNA提取使用SV 96 total RNA isolation system试剂盒(Promega，USA);cDNA合成使用iScriptTMcDNA合成试剂盒(BioRad，USA)，4℃冰箱保存备用。

1.2.2 引物和探针制备 本试验所需引物和单链核苷酸探针序列如表1所示，该对引物正向引物经生物素(Biotin)标记，引物扩增获得的产物大小在450 bp左右，该产物包含S-RNas e等位基因的高变区(RHV)。各S基因等位基因单链核苷酸探针主要是根据各S等位基因RHV区域序列设计获得，各探针Tm值均为60℃。用于检测PCR产物的探针，除了包含S等位基因探针序列，还包括一个6 bp的TATATT间隔序列和一个23 bp的检测序列(5'-TACATTCGCAATTGAGGCTTCGT-3')，该检测序列与地高辛(Digoxin)标记的检测探针序列互补。杂交的原理如图1所示。

1.2.3 序列杂交 各品种S等位基因DNA片段通过PCR扩增获得。PCR反应体系为:50μl反应体系中加入20 ng cDNA，20 pmol正反向引物，1×Ex Taq缓冲液，400 μmol/L dNTPs，2.5 U Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa Biomedicals，Japan)。PCR扩增40个循环，每个循环包括94℃ 变性30 s，55℃ 退火30 s，72℃ 延伸 1 min。反应结束后，每5μl PCR产物添加100μl PBST缓冲液和50μg链酶亲和素包裹的磁力球(Roche，Germany)，94℃孵育30 min。随后，加入50μl变性溶液(0.5 mol/L NaOH，10 mmol/L EDTA)，使磁力球结合的PCR产物变成单链，PBST缓冲液冲洗2遍。再加入200μl杂交缓冲液(5×SCC 缓冲液，0.3%Tween-20，50 pmol S等位基因探针和地高辛标记的检测探针)，50℃杂交2 h。PBST缓冲液清洗2遍，与含1%抗地高辛碱性磷酸酶(Anti-digoxigenin IgG Fab fragment conjugated with alkaline phosphatase，Roche，Germany)的 PBST缓冲液室温孵育30 min。PBST清洗2次后，再与PNPP(Thermo，USA)在37℃反应，根据颜色变化判断杂交结果，如果呈黄绿色，表示该S等位基因探针与PCR产物互补，即该品种包含1个该S基因型。

图1 PCR-ELSIA梨树S基因型鉴定法流程示意图Fig.1 Schemes of S genotyping in pear by PCR-ELSIA method

2 结果

在本试验中，我们一共设计了7个单链核苷酸探针，各探针分别与Pyrus pyrifolia S-RNase中的S1、S2、S3、S4、S5、S6和 S7等位基因特异互补。探针序号与其对应的等位基因序号相同。完成所有试验步骤后，如果该溶液呈黄绿色，表明PCR产物与该S等位基因特异结合，即测试品种拥有此S等位基因。

试验中，一共测试了8个品种，除品种秋荣外，每一个品种花柱RNA反转录获得的cDNA扩增获得的PCR产物都能与2个探针互补杂交结合(图2)。其中爱宕能与探针2和探针5结合，爱甘水能与探针4和探针5结合，二十世纪能与探针2和探针4结合，丰水能与探针3和探针5结合，今村秋能与探针1和探针6结合，新高能与探针3和探针9结合，幸水能与探针4和探针5结合。杂交结果符合各品种S基因型。因为S4sm在秋荣花柱中不表达，所以秋荣PCR产物只与探针5呈阳性反应。其他无探针结合杂交，溶液则无明显颜色反应。

图2 PCR-ELSIA梨S基因型鉴定探针杂交后PNPP颜色反应结果Fig.2 The coloring reaction with PNPP of Sgenotype by PCRELISA after probe hybridation

3 讨论

S基因型鉴定是果树栽培中一项重要任务，它为果园授粉树的配置提供依据。S基因型鉴定最早是通过观察授粉后坐果率或者花粉管生长情况获得，随后该方法被更加快速、可靠的PCR扩增法取代。目前，最常用的方法就是通过通用引物扩增，电泳鉴定PCR产物大小的方法判断S基因型。这种方法缺陷是不能区分大小相近的S等位基因［9-11］。为了解决这个问题，有学者提出使用半自动测序仪精确测定 PCR 产物大小［1-3，12］，该方法可以精确分辨产物1 bp大小差别，但是该方法需要使用昂贵的仪器。本研究利用等位基因特异探针鉴定PCR产物，不需要昂贵仪器，与半自动测序仪法相比更易操作。此外，Kitashiba等［4］开发出一种圆点杂交法鉴定果树S基因型方法，但此方法过于灵敏，需要通过预备试验，获得每个探针最适杂交温度，否则会产生假阳性反应。

我们曾经利用相似原理鉴定李子和樱桃S基因型［13］。李子和樱桃S基因型鉴定，既可以通过花粉自交不亲和性因子SFB基因序列鉴定，也可以通过花柱自交不亲和性因子S-RNase基因序列鉴定。本研究，我们又运用该方法鉴定梨树S基因型。梨树S基因型只能根据S-RNase基因序列判断，这主要是因为梨花粉S基因至今未被鉴定。在李子、樱桃S基因型鉴定中，因为在高变区存在500 bp以上内含子，我们根据所有等位基因序列设计1个正向通用引物和多个等位基因特异反向引物，再利用多引物PCR扩增梨品种S-RNase高变区。在多引物PCR中，存在引物之间相互影响，我们根据S-RNase基因编码区设计了1对通用引物，利用花柱RNA反转录获得cDNA作为PCR模板，扩增S-RNase基因高变区，不存在多引物干扰问题，同时回避了多数梨S-RNase基因没有内含子序列的问题。除秋荣外，所有品种都与2个探针呈阳性反应，结果与各品种的S基因型一致，表明该方法非常可靠。品种秋荣所含S4sm-RNase基因发生突变，在花柱中不表达，因此无法检测到其信号。

在该方法中，用于检测S基因型的探针都包含3段序列，第1段是与各S基因型对应的等位基因互补序列，第2段是与地高辛标记的检测探针互补的检测序列，第3段是分隔上述两部分的间隔序列。S-RNase等位基因探针通过与地高辛标记检测探针杂交结合间接获得地高辛标记。通过这种设计，避免每个探针都用地高辛标记，只需合成1个地高辛标记的检测探针，从而大大降低试验成本，尤其在多个探针时，更能体现出该方法的经济性。

虽然在我们试验中，由于材料限制只选取了8个品种，7个S基因型，但我们在设计引物和探针时，比较了数据库中所有梨S基因型，保证各探针的特异性。在对梨品种S基因型进行鉴定时，可将已经公布的S等位基因分成多个组，以组为单位分别检测，从而减少工作量。

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