氟对幼龄茶树叶绿素含量及抗氧化酶活性的影响

李春雷， 倪德江

(1.潍坊科技学院，山东 寿光 262700;2.华中农业大学园艺林学学院/园艺植物生物学教育部重点实验室，湖北 武汉430070)

茶树是一种富氟的植物，每千克成熟叶片中氟含量可达到上千毫克［1-2］，但生产中茶树未见明显的氟中毒症状，并且氟也不被认为是茶树生长的必需元素。茶叶中过高含量的氟不仅危害人体健康，引起氟骨症、氟斑牙［3］等病，也会影响茶树本身的生理生化指标。近年来多项研究结果表明，茶树体内过量的氟不仅会降低茶叶的滋味及香气等品质［4-6］，而且会影响叶绿素合成及光合作用，破坏细胞膜及叶绿体等细胞结构［7］，影响多种酶的活性［8-9］。近几年已有一些学者从茶树抗氧化系统方面来研究茶树耐氟的原因，但大多研究不同氟浓度对茶树抗氧化性的影响，鲜有氟处理下茶树抗氧化系统的动态响应方面的研究，本研究以福鼎大白茶为试验材料，采用水培法，研究氟处理下茶树抗氧化系统的动态变化及茶树富集氟的特性，为深入研究茶树中氟的毒害及解毒机理提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

本试验幼龄茶树为福鼎大白1年生扦插苗，由湖北省农业科学院果茶研究所提供。

1.2 试验设计

试验在华中农业大学实验基地温室中进行。选择生长健壮、长势较一致的茶苗，栽植前洗净茶苗根部，采用营养液培养，其配方为1/2 Hoagland+Arnon［10］。在茶苗处理期间每天用1 mol/L的盐酸和氢氧化钠调整营养液pH为5.5±0.1，每3 h通气1 h，每5 d换1次营养液。缓苗10 d后，以F=0 mg/L为对照，设置F=16 mg/L(NH4F)进行处理，处理6 h，12 h，24 h，48 h，72 h 后分别收集第3 片、第4片茶苗鲜叶，经液氮快速冷冻后于－80℃超低温冰箱贮存备用。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 酶液提取 称取0.500 0 g去除主脉的鲜叶置于预冷的研钵，加入0.500 0 g石英砂和10 ml预冷的pH为7.8、含有0.1 mmol/L EDTA、5%PVP的50.0 mmol/L磷酸缓冲液，置于冰浴上研磨至匀浆，匀浆液于16 000 r/min(4℃)离心15 min，上清液用于测定 SOD、CAT、POD 活性［11］。

1.3.2 测定方法 叶绿素、类胡萝卜素含量测定参考Jiang［12］的方法。超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、过氧化氢(H2O2)含量均采用试剂盒(南京建成生物工程有限公司生产)测定。过氧化物酶(POD)活性的测定采用愈创木酚法［7］。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法 测定。

1.4 数据分析

采用 Excel 2003进行数据计算和作图，采用SAS分析软件进行LSD显著性检验及相关性分析。

2 结果与分析

2.1 茶树叶片中的氟含量

由图1可知，随着处理时间的延长，对照茶树叶片中的氟含量变化趋势平稳，加氟处理下随着处理时间的延长茶树叶片中的氟含量显著升高，在6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 分别比 0 h 升高 3.89%、8.55%、6.41%、11.39%、14.68%。加氟处理茶树叶片中的氟含量比对照显著升高，在 6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 分别比对照增加 3.09%、10.17%、8.67% 、14.27% 、13.76% 。

图1 氟处理下茶树叶片中氟含量变化Fig.1 Changes of fluoride content in tea leaves with fluoride treatment

2.2 氟对茶树叶片中叶绿素、类胡萝卜素含量的影响

加氟处理和对照的茶树叶片中叶绿素a的含量随着处理时间的延长均呈波浪形变化，在12 h和24 h时，加氟处理与对照差异显著，其他处理时间，加氟处理与对照差异均不显著(图2A);叶绿素b在加氟处理6 h时显著低于加氟处理0 h，比加氟处理0 h时含量降低16.90%，之后随着时间的延长，叶绿素b含量变化趋于平缓，但显著低于对照，加氟处理6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 时分别比对照降低19.14%、7.01%、22.46%、16.23%、12.66%(图2B)。这说明在短时间内氟对叶绿素b的影响大于对叶绿素a的影响。总叶绿素含量的变化趋势与叶绿素b的变化趋势相似，在12 h时，加氟处理的总叶绿素含量略高于对照，其他时间均显著低于对照(图2C)。叶绿素a/b在加氟处理6 h时显著高于加氟处理0 h，比加氟处理0 h时含量高16.48%，之后随着时间的延长，a/b变化趋于平缓，但均显著高于对照，加氟处理 6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 时分别比对 照 增 大 了 13.88%、11.56%、12.24%、14.43%、14.52%(图2D)。氟对类胡萝卜素含量的影响不显著(P＜0.05)，与对照相比，只是在加氟处理12 h时显著高于对照，其他时间均与对照差异不显著(图2E)。

图2 氟处理下茶树叶片中叶绿素及类胡萝卜素含量变化Fig.2 Changes of chlorophyll and carotenoid contents in tea leaves with fluoride treament

2.3 氟对茶树抗氧化酶的影响

超氧化物歧化酶(SOD)是存在于植物细胞中最重要的清除自由基的酶类之一，它的主要功能是清除O2·－的过多积累，缓解逆境对植物体的伤害［14］。由图3A可知，对照茶树叶片中SOD活性随着时间的延长呈波浪形变化，但差异不显著;加氟处理的茶树叶片中SOD活性随着时间的延长显著降低，在加氟处理 6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 分别比加氟处理 0 h下 降 6.19%、10.44%、12.78%、16.52%、24.48%。加氟处理茶树叶片中SOD活性比对照显著下降，在加氟处理6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 茶树叶片中 SOD 活性分别比对照 6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 下降 6.8%、14.0%、12.6%、21.2%、22.8%。

图3B和图3C表明，对照茶树叶片中POD、CAT活性基本没有变化，加氟处理的茶树叶片中POD、CAT活性随着时间的延长均先升高后降低，两者活性均在48 h达到最大值。其中加氟处理48 h茶树叶片中POD活性分别比加氟处理0 h及对照48 h高31.47%和46.51%，加氟处理72 h时POD活性下降，但仍显著高于加氟处理0 h的POD活性及对照72 h时POD活性，分别高出18.3%和33.68%;加氟处理48 h茶树叶片中CAT活性分别比加氟处理0 h及对照48 h时CAT活性增大36.79%和30.17%，加氟处理72 h时CAT活性下降，但仍显著高于加氟处理0 h及对照72 h的CAT活性，分别高出29.43%和32.35%。

2.4 氟对茶树叶片MDA、H2O2含量的影响

MDA是膜脂过氧化产物，其含量的多少反映细胞膜脂过氧化程度强弱。由图4可以看出，随着时间的延长，加氟处理和对照茶树叶片中的MDA含量均呈升高趋势。在12 h时，加氟处理的MDA含量显著高于对照的MDA含量，其他时间加氟处理茶树叶片中的MDA含量与对照差异均不显著。说明在短时间内加氟处理的膜质过氧化反应程度较弱，未对茶树造成伤害。在加氟处理下，H2O2含量先升后降。在加氟处理6 h和12 h H2O2含量显著高于对照，加氟处理24 h和72 h H2O2含量与对照无显著差异，这也说明膜质过氧化反应较轻。

图3 氟处理下茶树叶片中SOD、POD、CAT活性的变化Fig.3 Changes of SOD，POD and CAT activities in tea leaves with fluoride treament

图4 氟处理下茶树叶片中MDA、H 2 O2含量的变化Fig.4 Changes of MDA and H 2 O2 contents in tea leaves with fluoride treament

3 讨论

植物抗氧化系统中保护性酶包括SOD、POD、CAT，在长期的进化过程中，这些保护性酶之间相互协调能及时清除植物体内过多的活性氧，从而使植物免受活性氧的伤害。SOD是植物防御外界伤害的第一道防线，主要功能是将歧化为O2和，POD和CAT将毒害能力更强的H2O2氧化为无害的H2O。我们前期的研究结果表明，不同浓度的氟对细胞结构(叶绿体、线粒体、细胞膜等)及抗氧化系统产生了较大影响，在低浓度氟处理下，抗氧化系统能够通过保护性酶的相互协调清除过量的活性氧，从而使细胞结构免受其伤害，在高浓度氟处理下，活性氧的产生速率超出了保护性酶的清除能力，致使活性氧积累，从而造成了细胞结构的破坏，这些都说明了抗氧化系统中的保护性酶对氟的积极响应［7］。在本研究中，随着处理时间的延长，SOD活性与对照相比显著降低，说明SOD活性对氟非常敏感。在不同浓度氟处理茶树的试验中，SOD活性也显示了对氟的敏感性，我们前期的研究结果显示随着氟浓度的增加SOD活性显著降低［7］，李品武等［17］的研究结果也表明随着氟浓度的增加名山131的SOD和CAT活性均逐渐降低，杜海荣等［18］用氟处理玉米发现SOD活性也随着氟浓度的升高而呈下降趋势。因为SOD是一种金属酶，含有Cu，Zn，Fe，Mn等金属元素，氟很可能会与这些金属元素络合而使SOD失活，这可能是氟处理下茶树SOD活性降低的原因之一。SOD活性的降低将导致O2·－清除减慢，但O2·－还能自动歧化为H2O2和水，CAT、POD将协调清除H2O2，将其催化为水。本研究中，CAT和POD均显示了积极作用，随着处理时间的延长两者活性均显著升高，且均比对照显著增加，显示了清除 H2O2的能力，唐茜等［19］、李品武等［17］以及我们前期的试验结果［7］显示，随着氟浓度的增加，CAT活性和POD活性均先升高后降低。

加氟处理下，叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量均比对照降低，说明氟影响了叶绿素的合成，本研究的结果显示氟对叶绿素b的影响要大于叶绿素a，而对类胡萝卜素影响不显著。

MDA含量是衡量膜质过氧化反应程度的重要指标。本研究中MDA含量与对照差异不显著，说明氟引起的膜质过氧化反应程度较轻。因此，在短时间(0～72 h)的氟胁迫下，茶树完全能够依靠体内抗氧化系统的保护性酶清除掉多余的活性氧，从而保护茶树不受伤害。

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