抗Cry1F 毒素单链抗体的筛选及初步应用

徐重新， 张存政， 何 鑫， 张留娟， 张 霄， 仲建锋， 刘 媛， 谢雅晶， 刘贤金

(江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所/江苏省食品质量安全重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地/农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室，江苏 南京210014)

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种革兰氏阳性细菌，在芽胞形成时产生的Bt毒素对多种昆虫具杀虫活性［1-3］。自Bt 被发现以来就一直作为生物农药用于各类害虫的防治，目前占据了微生物农药95 % 以上的市场［4］。Cry1F 毒素是Bt 毒素的一种，主要用于防治地上鳞翅目害虫［5］。现有转Cry1F 毒素的转基因作物主要为玉米和棉花，如抗虫玉米TC1507、抗虫棉花281-24-236 等，均已实现商业化生产和推广。目前Cry1F 毒素的检测方法主要是基于单克隆抗体、多克隆抗体的免疫学检测方法，包括ELISA 法［6-7］和商业化的免疫金标试纸条法等，另外还有采用表面等离子共振技术检测的报道［8］。

噬菌体抗体库技术是基于基因工程抗体改造技术发展而来的噬菌体表面展示技术。该技术的原理是将改造后的抗体基因克隆到丝状噬菌体噬菌粒载体上，随着噬菌粒串联共表达，使其展示在噬菌体衣壳蛋白质表面形成融合形式蛋白质抗体，从而将抗体的表型和基因型联系为一体，再通过与固相化抗原结合的特性进行筛选，获得抗原特异性的单链抗体(scFv)［9］。噬菌体抗体库技术，避免了传统方法获取单克隆抗体、多克隆抗体所要经历的抗原乳化、动物免疫及采血等繁琐过程，通过抗体库富集筛选直接获得具有抗原结合活性的抗体，并可以进一步在基因水平上改造抗体的结构和功能，同时也能在原核、真核以及重组病毒中进行快速、大量的表达。Garet 等［10］利用噬菌体抗体库技术成功筛选到了具有抗海葵毒素活性的scFv，并建立了免疫学检测方法。Zhang 等［11］也从噬菌体抗体库中筛选到了抗Cry1B 毒素的scFv，并建立了针对Cry1B 毒素的间接竞争ELISA 检测方法，均取得了良好效果。本研究旨在利用噬菌体抗体库技术筛选具有Cry1F 毒素结合活性的scFv，并建立有别于单克隆抗体、多克隆抗体的新型基因工程改造抗体检测Cry1F 毒素的免疫学检测方法，为转Cry1F 毒素基因作物及其产品的检测探索新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

Cry1F、Cry1C、Cry1B、Cry1Ab、Cry1Ac 毒 素标样购自上海佑隆生物科技有限公司;Tomlinson I 噬菌体抗体库、辅助噬菌体KM13、Escherichia coli TG1、E. coli HB2151 购自英国剑桥大学分子生物学实验室和蛋白质基因工程中心;酶标仪购自美国Thermo 公司;酶标板购自美国Corning 公司;anti-M13［HRP］antibody、anti-His［HRP］antibody、His-Trap HP、超微量分光光度计Nano Vue Plus spectrophotometer 购自美国GE 公司;卡那霉素、氨苄青霉素购自美国Sigma 公司;DNA marker、protein marker 购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗Cry1F 毒素scFv 的富集 将500 μl Tomlinson I 噬菌体抗体库菌液加入2 × TY-AG 培养基(含终浓度100 μg/ml的Amp、1%的葡萄糖)中，37℃培养到OD600为0.4。取50 ml 菌液，加入1 ×1012PFU 辅助噬菌体KM13 进行侵染，37 ℃孵育30 min，3 300 g 离心10 min，弃上清液，沉淀用100 ml 2 ×TY-AKG 培养基(含终浓度100 μg/ml的Amp、50 μg/ml的Kana、1 %的葡萄糖)重悬，30 ℃培养过夜。次日3 300 g 离心30 min，取上清液并加入20 ml PEG/NaCl 溶液，冰浴1 h ，3 300 g 离心30 min，弃上清液，用4 ml PBS 重悬沉淀，再以11 600 g 离心10 min，收集上清液，即为扩增的噬菌体抗体库，置于4 ℃保存备用。取扩增的Tomlinson I 库与固相化包被的Cry1F 毒素共同孵育:第1 轮将4 ml 75 μg/ml (其后2 轮依次为50 μg/ml、10 μg/ml)Cry1F 毒素包被于细胞培养瓶底部，4 ℃过夜，次日用1 ml PBS 清洗细胞培养瓶3 次。取扩增的抗体库与4 ml 3 %的MPBS(PBS 溶液中含有3 %的脱脂奶粉)溶液充分混匀后加入细胞培养瓶，室温下缓慢摇动1 h，再静置1 h ，倾去瓶中液体。以PBST(PBS 溶液中含有0.05%的吐温-20)洗瓶数次，然后加入1 ml 胰蛋白酶(Trypsin)溶液洗脱特异性结合的噬菌体scFv，收集后侵染E. coli TG1 扩增进行下一轮筛选。如此3 轮筛选即可富集与Cry1F 毒素特异性结合的噬菌体scFv。

1.2.2 抗Cry1F 毒素scFv 的筛选及鉴定 取第3轮富集的噬菌体scFv 侵染E.coli TG1，37 ℃孵育1 h 后，涂布于TYE-AG(含终浓度100 μg/ml的Amp、1.0%的葡萄糖、1.5%的琼脂)上，37 ℃培养过夜。随机挑取长出的单菌落，接种到加有2 ×TY-AG 培养基的96 孔板中，37 ℃培养过夜。从板孔中吸出2 μl 转接到新的96 孔板中，37 ℃孵育2 h，每孔加入25 μl 辅助噬菌体，30 ℃孵育2 h，1 800 g 离心10 min，用150 μl 2 ×TY-AK 重悬沉淀后30 ℃培养过夜。次日1 800 g 离心30 min，取上清液加入到包被有Cry1F 毒素(浓度为4 μg/ml)的96 孔板中，阴性对照为等量的2 × TY 培养基。37 ℃水浴2 h，以PBS 洗板3 次，加入100 μl anti-M13［HRP］(1∶1 000)，37 ℃孵育2 h，再次洗板，然后加入100 μl四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine，TMB)显色液，室温反应15 min，以50 μl 浓度为1.96 g/ml 的H2SO4终止反应。用酶标仪测OD450值，阳性/阴性大于2.1，即判断为阳性。

1.2.3 抗Cry1F 毒素scFv 的可溶性表达 scFv的可溶性表达及纯化方法参考文献［11］步骤进行。

1.2.4 IC-ELISA 检测方法的建立及特异性分析取酶标板，板孔加入100 μl 以CBS 稀释的Cry1F 毒素(2.5 μg/ml)，室温包被过夜。洗板3 次后，加入200 μl 3%的MPBS 溶液，37 ℃水浴封闭2 h，再次洗板，每孔分别加入50 μl 浓度为2.0 μg/ml的可溶性scFv 和50 μl 浓度为10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml、600 ng/ml、800 ng/ml的Cry1F 毒素标样混合液，37 ℃水浴2 h，洗板加入100 μl anti-His［HRP］(1∶ 1 000)，37 ℃水浴2 h。洗板加入四甲基联苯胺显色液，室温反应15 min，终止反应。测OD450，以Cry1F 毒素浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标，建立Cry1F 毒素的IC-ELISA 检测方法。分别以Cry1F 毒素的类似物:Cry1C、Cry1B、Cry1Ab、Cry1Ac 作为竞争抑制物，测定交叉反应率(CR)［12］，评价该方法的抗原特异性。

1.2.5 添加回收试验 取玉米烘干磨成粉，过100目筛，称取1 g 加入到4 ml 试管中，共3 管。随后加入Cry1F 毒素，充分混匀，使其终浓度分别为10 ng/g、100 ng/g、500 ng/g。每管加入1 ml 样品提取液(0.10 mol/L 碳酸盐缓冲液，pH 9.6，0.05%Tween-20)，室温振荡4 h ，然后5 000 r/min 离心5 min ，取上清液保存待用。分别取上述3 个浓度的提取物溶液，同1 d 每个样品测3 次，连续测3 d，计算添加回收试验中Cry1F 毒素的回收率(回收率=检测值/理论值×100 %)及变异系数(CV =相对标准偏差/回收率)。

2 结果与分析

2.1 特异性多克隆噬菌体scFv 的免疫分析

特异性多克隆噬菌体免疫分析，是采用非竞争ELISA 法对原始抗体库和3 轮富集筛选的次级库对抗原的整体亲和力进行鉴定。如图1 所示，原始抗体库噬菌体的ELISA 值(OD450)为0.21，第1 轮富集筛选后的次级库OD450为0.34，第2 轮富集筛选后的次级库OD450为0.82，第3 轮富集筛选后的次级库OD450为1.50。结果表明，经过3 轮富集筛选后，抗原特异性噬菌体得到有效富集，可用于抗Cry1F 毒素scFv 的筛选。

2.2 阳性单克隆的ELISA、PCR 及测序鉴定

经第3 轮筛选后，随机挑取噬菌体单克隆进行单克隆噬菌体ELISA 鉴定，以阳性值/阴性值(P/N)大于2.1 为阳性标准，结果筛选出11 个阳性单克隆(图2)。经通用引物(LMB3:5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3';pHEN:5'-CTATGCGGCCCCATTCA-3')进行PCR 鉴定(图3)，11 个阳性单克隆均含有935 bp 大小的目的基因条带。选取H1 和G9阳性单克隆菌种进行DNA 测序(图4)，经NCBI 比对分析，均具有3 个完整的重链可变区(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3)、轻链可变区(L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)，及1 条重、轻链之间的Link 序列，由此确认为人源化的scFv 基因。H1 和G9 的scFv 蛋白氨基酸序列仅在L-CDR1 区存在2 个氨基酸的差异，我们初步推断L-CDR1 区可能是影响scFv 抗原结合活性的关键位点。

图1 3 轮筛选的多克隆噬菌体免疫分析结果Fig.1 Immunoassay of polyclonal phage after three rounds of binding

图2 ELISA 筛选阳性单克隆Fig.2 ELISA for screening positive monoclones

图3 11 株阳性克隆的PCR 鉴定Fig.3 PCR identification of 11 positive clones

图4 H1、G9 阳性重组噬菌体scFv 的氨基酸序列Fig.4 The amino acid sequences of positive recombinant phage scFv of H1 and G9

2.3 scFv 的可溶性表达

将G9 阳性噬菌体scFv 通过宿主替换的方式导入到E. coli HB2151 中进行可溶性表达，收集培养上清液过anti-His-Tag 亲和层析柱纯化，采用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白质。如图5 所示，通过不同浓度(50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L、500 mmol/L)的咪唑洗脱缓冲液进行梯度洗脱，上清液中杂蛋白质被逐级洗脱下来，目的蛋白质获得纯化，最后在400 mmol/L 咪唑洗脱缓冲液(泳道4)中收集到了大量纯化的scFv 蛋白质，定容至1 ml，经微量分光光度计测得目的蛋白质浓度为256 μg/ml。由此说明抗Cry1F 毒素的scFv(G9)在E. coli HB2151中的可溶性表达获得成功，可进行下一步活性测定及抗原特异性分析。

图5 scFv 经不同浓度洗脱液洗脱纯化后的SDS-PAGE 电泳Fig.5 SDS-PAGE analysis of scFv after elution and purification

2.4 IC-ELISA 检测法的建立及特异性分析

如图6 所示，以可溶性表达的scFv(G9)为检测抗体，采用IC-ELISA 法，建立针对Cry1F 毒素的标准抑制曲线。其线性回归方程为Y =0.099 0x +9. 407 0(R2= 0.989 2)，其中，Y 为抑制率(%)，x 为Cry1F 毒素浓度(ng/ml)。计算得到该检测方法的检测灵敏度(IC10)为5. 99 ng/ml，抑制中浓度(IC50)为0. 410 μg/ml，线性检测范围(IC20～IC80)为0. 107 ～0. 713 μg/ml。Cry1B、Cry1C、Cry1Ab 和Cry1Ac 作为Cry1F 毒素的类似物，在建立的IC-ELISA 法中测得交叉抑制试验结果如表1 所示，scFv(G9)对Cry1C、Cry1B 均具有一定的识别能力，交叉反应率分别达到了20. 92 % 和15. 59 %，而对Cry1Ab、Cry1Ac 交叉反应率均低于0. 1%，识别能力几乎可以忽略。

图6 IC-ELISA 法检测Cry1F 毒素的标准抑制曲线Fig.6 Standard inhibition curve for Cry1F toxin by IC-ELISA

表1 Cry1F 毒素类似物的交叉反应Table 1 Cross reactivity between scFv and Cry1F toxin analogous

2.5 Cry1F 毒素在玉米中的添加回收

为测试基于scFv(G9)的IC-ELISA 检测法的实用性，我们在该方法线性检测范围(IC20～IC80)内，分别做了500 ng/g、100 ng/g、10 ng/g 3 个Cry1F 毒素浓度水平在玉米中的添加回收试验。结果如表2所示，3 个样品浓度的批内回收率为85.43% ～94.71%，变异系数为6.43% ～9.13%;批间回收率为 82.26% ～91.61%，变 异 系 数 为 7.99% ～9.00%。批内、批间试验均满足仪器检测的稳定性和重复性的要求。

3 讨论

Tomlinson I 噬菌体抗体库表达载体pIT2 是由丝状噬菌体改造而来的一种噬菌粒，在多克隆位点与gⅢ蛋白质编码区之间有1 个His-tag 序列和琥珀终止密码子(UAG)。当携带scFv 基因的噬菌粒在琥珀突变抑制基因的宿主(E. coli TG1)中表达时，UAG 被译读为谷氨酸，scFv 与gⅢ蛋白质融合，在辅助噬菌体的营救下，组装成展示在噬菌体衣壳蛋白质表面的融合形式的scFv;当携带scFv 基因的噬菌粒在非琥珀突变抑制的宿主(E.coli HB2151)中时，UAG 则被译读为终止密码子，scFv 终止于His-tag，形成可溶性的scFv-Histag 蛋白质，并被分泌到胞外［13］。本研究正是利用Tomlinson I 噬菌体抗体库的这个特点，先从库中筛选具有Cry1F 毒素结合活性的展示型噬菌体scFv，然后通过宿主替换的方式(由E. coli TG1替换为E. coli HB2151)，直接将展示型的噬菌体scFv 转为能可溶性表达的scFv-His-tag 蛋白质，并通过His 标签进行纯化收集和间接活性测定。该方法跳过了外源基因在表达时需要“构建重组载体→化转感受态细胞”的繁琐过程，大大提高了获取scFv 蛋白质的效率。以可溶性scFv(G9)为检测抗体建立的IC-ELISA 法检测灵敏度(IC10)为5. 99 ng/ml，比商业化的转Bt 基因毒素ELISA 检测试剂盒(IC10为0. 5 ng/ml)［14］的灵敏度约低10 倍。由此说明，初筛的scFv 抗原结合活性与单克隆抗体、多克隆抗体还存在一定差距，不过，在后期研究中可以考虑采用不同的表达系统(昆虫细胞表达［15］)和抗体亲和力成熟改造技术(易错PCR［16］、定点突变［17］、链置换［18］等)，进一步提高scFv 的亲和活性，以达到检测所需灵敏度的要求。从抗原特异性来看，因为选取的对象(Cry1B、Cry1C、Cry1Ab、Cry1Ac)少，并不能有效说明scFv(G9)是否具有广谱识别能力，后期可以扩大抗原类似物种类(如:Cry1Aa、Cry1D、Cry1E、Cry2Aa、Cry2Ab、Cry3A、Cry3A、Cry34/Cry35 等)进行交叉抑制试验，并从中摸索规律，为scFv 的广谱识别检测改造提供指导。

表2 玉米中Cry1F 毒素的IC-ELISA 检测法批内、批间的添加回收率和变异系数Table 2 Recoveries and coefficients of variation of intra-and inter-assays for detection of Cry1F toxin by IC-ELISA in corn

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