分散液相微萃取-高效液相色谱法测定水体中毒死蜱残留

贺 江， 龙海波

(湖南文理学院生命科学学院，环洞庭湖水产健康养殖与加工湖南省重点实验室，湖南省水产高效健康生产协同创新中心，湖南 常德415000)

随着经济和社会的发展，中国水产品的消费量逐年上升，与此同时，水产养殖业在中国环洞庭湖等地区已成为农民增收的重要途径。然而，水体中农药残留等化学污染物的积累严重制约了中国水产养殖业的健康发展，建立水体中此类化学污染物的监测技术，成为水产品安全生产体系中的核心环节之一。毒死蜱是目前中国农业生产中广泛应用的一种有机磷杀虫剂，它的使用使水体中积累毒死蜱农药残留的风险增大。中国现行的各级农药残留检测标准方法多是基于色谱或色谱-质谱联用技术，标准方法中的样品前处理技术仍以液液萃取技术为主，其存在操作繁琐耗时、有机溶剂使用量大、难以实现自动化等不足。

针对传统样品前处理技术的各种不足，建立省时高效、有机溶剂耗用量少的样品前处理新技术一直是分析化学领域、食品安全检测领域的一个热门研究方向［1］。近年来国内外学者发展建立起了多种新型样品前处理技术，例如固相萃取(Solid-phase extraction，SPE)技术［2-3］、超临界流体萃取(Supercritical fluid extraction，SFE)技术［4-5］、固相微萃取(Solid-phase micro extraction，SPME)技术［6-7］、悬滴微萃取(Single drop micro extraction，SDME)技术［8-9］、基于中空纤维的液相微萃取(Hollow fiber-liquid phase micro extraction，HF-LPME)技术［10］、分散液相微萃取(Dispersive liquid-liquid micro extraction，DLLME)技术［11-14］等。其中DLLME技术自建立以来，受到了国内外诸多学者的重视，该技术集采样、萃取和浓缩于一体，避免了固相微萃取中可能存在交叉污染的问题，是一种操作简单、快速、成本低、富集效率高且对环境友好的样品前处理新技术，在对液体样品进行处理时DLLME技术的优势尤为显著。

本研究拟建立水体中毒死蜱的DLLME—HPLC分析检测技术，重点对DLLME技术中萃取剂与分散剂种类的选择、萃取剂与分散剂用量的确定、样品盐浓度及pH等条件进行优化，使水体中毒死蜱残留检测技术得到改进，也可为水体中其他类型化学污染物的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

毒死蜱标准品(来自中国食品药品检定研究院)，四氯化碳、三氯乙烷、二氯甲烷、四氯乙烯、三氯甲烷(分析纯，上海化学试剂有限公司生产)，乙腈、丙酮、乙醇、甲醇(色谱纯，天津市康科德科技有限公司生产)。

1.2 仪器与设备

P680高效液相色谱仪(美国戴安公司生产)，配可变波长紫外检测器和自动进样器;Diamonsil ODS色谱柱(250.0 mm×4.6 mm，5μm ODS C18，迪马科技有限公司生产);UV-1750型紫外可见分光光度计(日本岛津制作所生产);TG16-II型高速离心机;涡旋振荡器;15 ml尖底具塞离心管;带支架的色谱自动进样瓶内插管。

1.3 方法与步骤

1.3.1 毒死蜱HPLC检测条件的设定 采用UV-1750型紫外可见分光光度计对毒死蜱标准溶液进行波长扫描，确定其最佳检测波长为300 nm。参照文献［15］，确定毒死蜱液相色谱分析条件如下:流动相为甲醇和水(9∶1，体积比)，流速为 1.0 ml/min，柱温25℃，进样量15μl。在该条件下，毒死蜱色谱峰与溶剂峰分离效果较佳，且峰形较好，其保留时间约为8.3 min(图1)。

图1 浓度为1.0μg/ml的毒死蜱液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatogram of 1.0 μg/ml chlorpyrifos

1.3.2 水体中毒死蜱DLLME技术关键参数的优化 用池塘水配制浓度为0.10 mg/L的毒死蜱模拟水样，用于毒死蜱DLLME条件的优化。具体过程如下:将一定体积的萃取剂和分散剂分别加入到15 ml尖底具塞离心管中，轻轻摇匀，然后加入10 ml毒死蜱模拟水样，轻轻振荡，萃取剂均匀地分散在水相中，形成水、分散剂和萃取剂的乳浊液体系，室温放置2 min。然后以3 000 r/min离心2 min，萃取剂沉积在离心管底部，吸取沉积相到带支架的色谱自动进样瓶内，按方法1.3.1所述条件进行HPLC分析。试验设置不同种类和不同用量的萃取剂和分散剂，以及不同盐浓度和pH的水体样品进行对比试验，以毒死蜱色谱峰面积为指标对上述条件进行优化。

1.3.3 水体中毒死蜱DLLME-HPLC分析技术的评价 用池塘水配制系列浓度的毒死蜱模拟水样，按优化的DLLME条件和方法1.3.1所述HPLC条件进行分析，建立基质标准曲线用于毒死蜱的定量分析，并以信噪比(S/N)为3所对应的水样毒死蜱浓度为检出限。用池塘水配制浓度为0.01 mg/L、0.10 mg/L、1.00 mg/L的水体模拟样品，按相同方法进行分析，以模拟样品分析的回收率评价方法的准确度，以回收率的变异系数评价方法的精密度。

2 结果与分析

2.1 水体中毒死蜱DLLME技术关键参数的优化

图2 萃取剂种类(a)及萃取剂(三氯甲烷)用量(b)对毒死蜱分散液相微萃取效果的影响(n=3)Fig.2 Effect of extraction agent variety(a)and volume(b)on DLLME of chlorpyrifos(n=3)

2.1.1 萃取剂类型及其用量的优化 根据DLLME技术原理，选择萃取剂的主要原则如下:密度必须大于水且不溶于水;对目标待测物的溶解能力大;还要有较好的色谱行为，不影响目标物的定性和定量分析［11-14］。以1 000μl甲醇作为分散剂，分别考察了四氯化碳(密度1.59 g/ml)、三氯乙烷(密度1.35 g/ml)、二氯甲烷(密度1.33 g/ml)、四氯乙烯(密度1.63 g/ml)、三氯甲烷(密度1.48 g/ml)5种萃取剂(用量均为100μl)对毒死蜱的萃取效果。结果表明，除二氯甲烷外，其他4种萃取剂都能使毒死蜱得到富集，其中三氯甲烷效果最佳(图2a)。在此基础上，进一步对三氯甲烷的最佳用量进行了探讨。结果表明，在分散剂体积一定时，随着萃取剂体积的增大，毒死蜱的色谱峰面积呈先增大后减小的趋势，用量为100μl时对毒死蜱的富集效果最佳(图2b)。

2.1.2 分散剂类型及其用量的优化 根据DLLME技术原理，分散剂应能完全溶解萃取剂，且易溶于水，分散剂作用是使萃取剂和水样溶液的接触面积最大，其在水中的溶解度越大，形成的液滴会越小，与目标物接触面积越大，萃取效率也越高［11-14］。以100μl三氯甲烷作为萃取剂，分别考察了乙腈、丙酮、乙醇和甲醇4种分散剂(用量均为1 000μl)对毒死蜱萃取效果的影响。结果表明，丙酮本身在300 nm处有较强吸收，不宜选用，其他3种分散剂中甲醇效果最佳(图3a)。分散剂的体积大小将影响萃取剂在水中的分散程度，从而影响沉积体积的大小，进而影响萃取效率。因此，本研究进一步对甲醇的最佳用量进行了探讨。结果表明，毒死蜱色谱峰面积随着分散剂体积的增加而增加，这是由于随甲醇体积增大，三氯甲烷在水中分散更充分，萃取效率也相对越高;甲醇用量为1 200μl时萃取效果达到最佳，进一步增大用量则沉积体积下降，影响进样要求，萃取效率也降低(图3b)。

2.1.3 水体样品NaCl浓度与pH的优化 样品的NaCl浓度和pH能够影响DLLME富集效果［14］。本研究以1 200μl甲醇为分散剂，100μl三氯甲烷为萃取剂，进一步考察水样NaCl浓度和pH对毒死蜱萃取效果的影响。结果表明，当在水体样品中添加0.2% ～20.0%的NaCl时，DLLME过程受到较大影响，难以获取到足量的沉积相用于后续HPLC分析，因此后续试验中不添加NaCl。当水体pH在5～10时，毒死蜱的富集效果变化较大;在6～8时富集效果较为稳定;pH为7时毒死蜱的富集效果最佳(图4)。

图3 分散剂种类(a)及分散剂(甲醇)用量(b)对毒死蜱分散液相微萃取效果的影响(n=3)Fig.3 Effect of dispersing agent variety(a)and volume(b)on DLLME of chlorpyrifos(n=3)

图4 水体样品p H对毒死蜱分散液相微萃取效果的影响(n=3)Fig.4 Effect of pH on DLLME of chlorpyrifos(n=3)

2.2 水体中毒死蜱DLLME-HPLC分析技术的评价

评价所建立的DLLME-HPLC分析技术对毒死蜱检测的有效性，进一步对该方法的灵敏度、准确度和精密度进行了研究。用池塘水配制系列浓度的毒死蜱模拟水样，按优化的DLLME条件和1.3.1所述HPLC条件进行分析，得到毒死蜱定量分析的基质标准曲线为 y=113.503 0x+0.516 5，R2=0.999 9(其中y为毒死蜱色谱峰面积，x为水样中毒死蜱浓度)。逐步稀释模拟水体样品，按同样方法进行分析，当模拟水样毒死蜱浓度为0.005 mg/L时，其峰面积约为基线噪声的3倍，故确定该方法的最低检出限为0.005 mg/L。对毒死蜱浓度为0.01 mg/L，0.10 mg/L，1.00 mg/L的水体模拟样品进行5次重复分析，得其回收率和变异系数(表1)，添加样品与空白水样的色谱图对比如图5所示。由表1可知，毒死蜱添加浓度为 0.01～1.00 mg/L时，添加回收率高于85%，变异系数低于7.5%，说明所建立的方法具有较好的准确度和精密度。

图5 空白水样(a)与毒死蜱添加样品(0.1 mg/L)(b)的色谱图对比Fig.5 The chromatogram of blank water sample(a)and spiked water sample(b)

3 讨论

分散液相微萃取集采样、萃取和浓缩于一体，是一种新型的样品前处理技术，与传统的萃取方法相比具有操作简单、快速、准确、成本低、对环境友好且回收率高和富集倍数高等特点，其在痕量分析领域中展现出愈来愈广阔的应用前景。本研究建立了水体中毒死蜱DLLME-HPLC分析检测方法，其关键参数为:以100μl三氯甲烷为萃取剂，1 200μl甲醇为分散剂，样品无需添加NaCl，样品酸碱度控制在中性为宜。该方法的最低检测限为0.005 mg/L，其准确度和精密度均能满足实际应用的要求。

表1 水体中毒死蜱DLLME-HPLC分析法的添加回收率及变异系数(n=5)Table 1 Spiked recovery and its coefficient of variation of chlorpyrifos in water by DLLME-HPLC(n=5)

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