甲氨基阿维菌素胁迫下福寿螺肝脏抗氧化酶活性及显微结构的变化

黄秀枝， 蔡瑷安， 尚战峰， 贤振华

(广西大学农学院，广西 南宁 530005)

自1981年福寿螺引入中国以来，其作为外来入侵物种，在新的环境和气候条件下，福寿螺失去了原有天敌的制约，加上盲目引进和管理不善，福寿螺大量生长繁殖，逐步扩散到稻田，成为一种新的为害水稻的有害生物［1-2］。随着螺源的逐年积累，福寿螺已成为为害中国水稻的恶性水生动物，严重威胁水稻生产［3］，被称为“为害最大的外来物种之一［4］”、“世界性恶性入侵水生动物［5］”和“为害水稻的恶性水生动物［6］”。

甲氨基阿维菌素(Methylamino abamectin)是一种新型的高效生物杀虫杀螨剂，具有低毒、无残留、无公害的特点，被广泛应用于农业生产中。其对菜青虫、棉铃虫、甜菜夜蛾、小菜蛾等鳞翅目害虫具有较高的杀虫活性［7-8］，对福寿螺的防治效果优于茶皂素和杀螺胺［9］。

超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)是生物体内的重要保护酶，可以清除细胞内多余的自由基，防止其毒害［10］。杨光研究发现，5.6 μg/L 以上的阿维菌素长时间胁迫对鲤鱼产生较强的氧化压力，使得机体抗氧化防御系统的正常功能受损，造成细胞或组织的不可逆损伤［11］。食用蟹在亚致死量的阿维菌素(10%)中暴露24 h，其鳃与肝胰腺的SOD活性上升［12］。杨家长等认为低浓度阿维菌素对鲤鱼SOD活性的影响较大［13］。李世凯发现伊维菌素对斑马鱼肌肉SOD活性表现为低浓度的抑制，高浓度先诱导后抑制［14］。

甲氨基阿维菌素尚未在软体动物中登记使用，其对福寿螺的毒性机理尚未清楚。本试验拟以福寿螺中螺为研究对象，研究甲氨基阿维菌素对福寿螺肝脏SOD、PO和CAT酶活性的影响，及其对福寿螺肝脏显微结构产生的病理变化，以期更系统地了解甲氨基阿维菌素在福寿螺体内的毒理。

1 材料与方法

1.1 试验螺源

试验螺为人工繁殖的第一代健康福寿螺中螺，体质量为(3.5±0.4)g，试验期间不投食。饲养水池保持水体流通，水质清新。

1.2 试验方法

1.2.1 甲氨基阿维菌素急性毒力测定 取68.3%甲氨基阿维菌素原药配制成母液，加水稀释成5个梯度浓度，分别为 0.80 mg/L、0.40 mg/L、0.20 mg/L、0.10 mg/L、0.05 mg/L，设清水为对照处理，每个处理重复3次。用桶 (8.75 cm×8.75 cm×16.50 cm)盛适当药液，保证福寿螺能浸泡于药液中。每桶投螺15只，加盖纱网，防止福寿螺逃逸。在(25±1)℃的恒温室浸泡福寿螺，每6 h观察福寿螺的行为和死亡情况，并清除死螺，48 h后统计死螺数，计算死亡率和校正死亡率。试验数据用DPS软件进行处理，计算福寿螺在48 h的急性毒力回归方程及LC25、LC50及LC75的浓度值。

1.2.2 福寿螺肝脏抗氧化酶活力测定 设置LC25、LC50、LC753个质量浓度和空白对照，每个浓度设3个重复，试验开始后分别于6 h、12 h、24 h、48 h取样，每组随机选择12只活螺，用自来水冲洗表面的药液，于冰盘上快速取出福寿螺的肝脏，吸干表面水分。快速称取1 g肝脏置于研钵中，用剪刀剪碎，加入液氮后快速研磨，加入缓冲液稀释。

1.2.2.1 SOD及PO酶源及活力测定 按质量体积1∶5的比例，即1 g组织中加入5 ml预冷的0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 6.8)冰浴、匀浆，4℃静置30 min，冷冻离心(4℃，10 000 r/min)30 min，取上清液作为酶源，上清液中的蛋白含量用考马斯亮蓝法［15］测定。邻苯三酚自氧化速率测定参考许申鸿和顾含真的方法［16-17］并作如下改进:依次加入0.1 mol/L Tris-HCl 4.5 ml缓冲液、4.2 ml二次蒸馏水，样品管加入2.50 mmol/L 0.3 ml邻苯三酚，于325 nm波长下测定吸光值。SOD酶活力单位定义为在25℃、pH 8.2时1 min抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量［18］。PO酶活力测定参照Benjamin的方法［19］稍加改进:在2.0 ml的测定体系［1.0 ml 0.10 mol/L，pH 6.8的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液和1.0 ml 8.00 mmol/L邻苯二酚］中加入200 μl酶源上清液，28℃检测430 nm处的吸光值。酶活力单位定义为以1 min催化底物氧化增加吸光值0.001的酶量［20］。

1.2.2.2 CAT酶源及活力测定 取0.6 g肝脏于匀浆器中，加入6.0 ml已预冷的Tris-HCl缓冲液(0.01 mol/L Tris，0.25 mol/L蔗糖，0.10 mmol/L EDTA，pH 7.5)，在冰浴下10 000 r/min匀浆，冷冻离心10 min［21］。在恒温25℃条件下，将CAT酶提取液加入H2O2-磷酸盐缓冲液中，采用1 cm比色皿在250 nm波长处每隔10 s测其吸光值。CAT酶活性单位定义为25℃、100 s内分解H2O2一半时的酶量［22］。

1.2.3 福寿螺肝脏显微结构观察 分别取清水(CK)、LC25、LC50及 LC75浓度处理6 h、12 h、24 h 及48 h受药严重且濒临死亡的福寿螺肝脏，将其用盐水洗净，经固定、脱水、包埋、切片、苏木精-伊红染色法(HE)染色后在光学显微镜下观察拍照。

1.3 数据统计

试验数据用平均值±标准误表示，组间数据用Duncan’s新复极差法进行显著性比较。

2 结果与分析

2.1 急性毒力测定

试验期间空白对照组(CK)的福寿螺正常，均无死亡。低浓度甲氨基阿维菌素给药处理后，福寿螺出现行动稍迟钝，爬行能力减弱等中毒症状;随着给药浓度提高，福寿螺呼吸管、触角及外套膜均出现中毒症状。在给药6 h内无死亡发生;给药48 h后，各处理出现了不同程度的死亡。给药48 h，甲氨基阿维菌素浓度与福寿螺死亡率呈线性相关关系(表1)。

表1 甲氨基阿维菌素对福寿螺的急性毒力试验Table 1 Acute toxicities of methylamino abamectin to Pomacea canaliculata

2.2 甲氨基阿维菌素对福寿螺肝脏SOD活性的影响

从时间-效应关系上，甲氨基阿维菌素为LC25浓度时，福寿螺肝脏的SOD酶活性在6 h开始升高，在24 h时出现峰值，此时较对照组高14.24%，差异极显著，但之后活性开始下降，到48 h时降至与对照水平几乎一致;甲氨基阿维菌素在LC50浓度时，福寿螺肝脏SOD酶活在给药6～24 h呈现显著的激活作用，酶活力在24 h时达高峰，约为对照组的1.4倍，之后回落至低于对照组水平，整个过程呈现出了上升-下降的过程;甲氨基阿维菌素在LC75浓度时，福寿螺肝脏内SOD酶活性则表现出先升后降的过程，6～12 h内，SOD酶活性均显著高于对照，6 h时达最大值，较对照组高28.33%，之后酶活逐步下降，至48 h时降至最低，较对照组降低了24.38%(图1)。从浓度-效应关系分析，在处理6～12 h时间段，随着浓度的增大，SOD活力呈现出增加的趋势，24 h时SOD活性则表现出LC50＞LC25＞CK＞LC75，此时浓度若达到LC75时，福寿螺肝脏的SOD活性已经受到抑制;48 h时，SOD活性为LC25＞CK＞LC50＞LC75。在甲氨基阿维菌素高浓度和长时间处理下，福寿螺肝脏体内SOD酶活力受到较强抑制(图1)。

2.3 甲氨基阿维菌素对福寿螺肝脏PO活性的影响

图1 甲氨基阿维菌素对福寿螺肝脏SOD活性的影响Fig.1 Effect of methylamino abamectin on the activity of SOD in the liver of P.canaliculata

福寿螺肝脏PO活性在处理6 h内呈现上升趋势，但随着暴露时间的延长，各处理组PO的活性开始下降(图2)。甲氨基阿维菌素浓度为LC25时，福寿螺肝脏PO酶活力在6 h急剧上升，6～12 h缓慢下降，之后急剧下降，至48 h时降至低于对照组水平;LC50浓度组，6 h时福寿螺肝脏PO酶活力上升趋势较LC25浓度组小，之后PO酶活力开始下降，至48 h酶活极显著低于对照;LC75浓度组PO酶活力的变化与LC25浓度组相似，均在6 h时最高，为对照组的2.4倍(P＜0.01)，但在12～48 h内急剧下降，48 h时PO酶活力极显著低于对照组水平(图2)。从浓度-效应关系分析，在12 h内，福寿螺肝脏PO活力表现出LC75＞LC25＞LC50＞CK，但在48 h时，呈现CK＞LC25＞LC50＞LC75(图2)。说明在长时间高浓度甲氨基阿维菌素胁迫下，福寿螺抵抗甲氨基阿维菌素的能力减弱，表现出了明显的时间和剂量效应。

图2 甲氨基阿维菌素对福寿螺肝脏PO活性的影响Fig.2 Effect of methylamino abamectin on the activity of PO in the liver of P.canaliculata

2.4 甲氨基阿维菌素对福寿螺肝脏CAT活性的影响

如图3所示，在甲氨基阿维菌素作用下福寿螺肝脏内CAT活性总体表现为上升-下降的趋势。甲氨基阿维菌素浓度为LC25时，福寿螺肝脏CAT酶活力在给药6 h时缓慢增大，24 h之后开始下降，至48 h时极显著低于对照组;甲氨基阿维菌素浓度为LC50时，福寿螺肝脏CAT酶活力在给药6 h时显著升高，随后逐渐下降，至48 h时，CAT酶活力较对照组少30.06%(P＜0.01);甲氨基阿维菌素在LC75浓度时，福寿螺肝脏CAT酶活性也表现出了先上升后下降的趋势，CAT活性在6 h处出现高峰，为对照组的2.3倍，随后急剧下降，至48 h时极显著低于对照水平。从浓度-效应关系来看，6～12 h时随着甲氨基阿维菌素浓度的增加，福寿螺体内肝脏CAT酶活力呈上升的趋势，而后则表现出随着浓度的增加而下降。说明短时间内(6～12 h)处理，甲氨基阿维菌素浓度越高，其对福寿螺肝脏内的CAT活力具有越强的激活作用，随着作用时间延长，福寿螺肝脏CAT酶活力受到抑制作用。

2.5 福寿螺肝脏显微结构的变化

正常福寿螺的肝脏消化小管结构完整、清晰，肝细胞未见异常(图4-1、4-2)。低浓度(LC25)甲氨基阿维菌素处理6 h后，其结构没有发生异常(图4-3)，浓度为LC50时，可见结缔组织中的血管有少量瘀血(图4-4)，浓度为LC75时，瘀血面积加大(图4-5)。甲氨基阿维菌素处理12 h时，福寿螺肝脏消化小管的结缔组织明显扩张，血管瘀血加重;消化小管的基膜变薄(图4-6)。甲氨基阿维菌素处理24 h时，LC25浓度组福寿螺肝脏整个结构出现弥漫性瘀血(图4-9);LC50处理组福寿螺肝脏消化小管的基膜大部分溶解坏死，细胞开始变形(图4-10)。甲氨基阿维菌素处理48 h时，福寿螺中毒严重，在低浓度下方可看见消化小管基膜，但结构不完整(图4-12);LC75组福寿螺肝脏上皮组织出现溶解坏死，结缔组织高度扩张，其间可见大量絮状坏死物，嗜碱性细胞和消化细胞变性，细胞畸形(图4-14)。

图3 甲氨基阿维菌素对福寿螺肝脏过氧化氢酶活性的影响Fig.3 Effect of methylamino abamectin on the activity of CAT in the liver of P.canaliculata

3 讨论

本研究发现各浓度组的福寿螺在不同的暴露时间下，其肝脏内SOD酶活力的变化趋势不同。甲氨基阿维菌素低浓度(LC25)组的福寿螺肝脏SOD酶活力变化不大，长时间(48 h)暴露后，与对照组无显著差异;中浓度(LC50)组福寿螺肝脏内SOD酶活力在24 h达到最大值，48 h其酶活力才被显著抑制;而高浓度(LC75)组的SOD酶活性比低、中浓度组在更快的时间(6 h)达到高峰后开始持续下降并在24 h时被极显著抑制。福寿螺中毒后，体内原有的自由基代谢受到了破坏，发生氧化损伤，在较轻的损伤程度下，福寿螺靠自身的抵抗防御作用，SOD发挥自身功能，清除掉多余的自由基，此时诱导的作用表现为适应性反应，但福寿螺在48 h高剂量的药剂下，SOD无法在较短的时间抵抗过多的自由基，防御系统遭到了破坏，SOD活性受到了抑制，解毒功能下降，表现出严重的中毒现象。表明甲氨基阿维菌素对福寿螺肝脏内SOD酶活性具有激活作用，但随着暴露时间的延长和暴露浓度的增加，激活能力下降，最终其肝脏SOD酶活力受到抑制。试验中观察到的SOD酶活性与其他相关研究中酶活性的变化类似，均呈先上升后下降的趋势［23-24］。

图4 福寿螺肝脏显微结构(×100)Fig.4 The microstructure of livers of normal(1 and 2)and methylamino abamectin treated P.canaliculat(3 to 14)

PO以PPO的形式存在于血液淋巴中，是黑色素合成的关键酶，同时也是昆虫体内的重要免疫蛋白。PPO一经活化成PO，则参与机体代谢过程的细胞吞噬、黑化作用和伤口愈合等过程，起防御作用［25］。本研究中暴露于甲氨基阿维菌素12 h的福寿螺，其肝脏PO酶活性波动大，以低浓度(LC25)、高浓度(LC75)组的福寿螺肝脏PO酶活性被显著激活，而中浓度(LC50)对福寿螺肝脏内PO酶活性无显著影响。短时间内，福寿螺肝脏内的PO先被激活，这与松油烯-4-醇对家蝇酚氧化酶具有激活作用［26］一致。而高浓度长时间(48 h)的暴露，则会使福寿螺体内PO酶活性受到抑制，这可能与破坏了黑色素的形成从而损坏了免疫系统有关。

短时间(6 h)胁迫下，福寿螺肝脏CAT酶活性均表现出激活作用，其中以高浓度(LC75)组福寿螺肝脏CAT酶活力激活效应显著，但在长时间胁迫下，肝脏内产生大量的H2O2，超出CAT的清除能力，机体受损。国内外也有大量研究表明，CAT酶活力受毒物剂量的影响，当浓度较低时，毒物对代谢有一定的促进作用［27-28］。各浓度组福寿螺肝脏CAT酶活力均呈现先上升后下降的变化趋势，这与阿维菌素胁迫下黄河鲤鱼鳃组织中CAT酶活力的变化趋势一致［12］。因此，CAT酶活性状况变化能够很好地反应机体受甲氨基阿维菌素的损害程度。CAT酶活性与其他两种酶活性是否具有相关性或与其他抗氧化酶酶活性及脂质过氧化酶酶活性是否有关联，有待进一步研究。

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