油桐粕蛋白降解菌LYT-1鉴定、促生长和拮抗特性研究

李培旺，李昌珠，赵梦瑞，张爱华，黎继烈，曹慧芳，2

（1.湖南省林业科学院省部共建木本油料资源利用国家重点实验室，湖南长沙 410004； 2.长沙环境保护职业技术学院，湖南长沙 410000； 3.中南林业科技大学生命科学与技术学院，湖南长沙 410004）

油桐（Vernicia fordii）是重要的工业木本油料植物之一。中国是油桐的主要栽培区，油桐籽产量居世界第一［1］。油桐籽主要用于榨取桐油，加工后的剩余物以油桐粕为主。油桐粕中含有36% ～45%的蛋白质、1%～2%的钾、1%～3%的磷等营养成分，是一种优质的植物蛋白质和有机肥原料，利用潜力巨大［2］。由于油桐粕中含有新二萜类酯、皂苷等对人畜有害的天然毒性成分，导致其利用受到限制，长期以来只能作有机肥还田使用［3-4］。郑威等［5］研究发现油桐粕有机-无机复混肥肥效高，有机质、氮、五氧化二磷、氧化钾分别为77.6%、4%～6%、1.8%～2.7%、1.2%～1.3%。赵梦瑞等［6］研究发现桐粕肥料具有改良土壤理化性质、促进植物生长和防虫抗病等作用。虽然，我国油桐粕肥料化是从唐、宋时期开始，历史悠久［7］，但油桐粕肥料化的传统方法主要以自然堆沤为主，发酵时间长，蛋白质等大分子物质降解程度低，产品功能单一，品质难以控制［8-9］。因此，通过多功能微生物将桐粕中蛋白质高效降解成易吸收的小分子氨基酸，开发出多功能生物有机肥，是解决目前油桐粕肥料化问题的有效方法，且此方法的关键在于可以获得兼具高产蛋白酶、拮抗病原菌和促生长特性的微生物菌种资源。目前，关于油桐粕高效降解的微生物菌种资源较少，方亭亭等［10］筛选出三株，分别为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、白色短小杆菌（Curtobacterium albidum）和肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus），但未对分解桐籽饼粕能力、促生长及拮抗特性进行深入研究，无法满足油桐粕生产多功能生物肥料的需要。本研究拟采用菌落形态、生理生化和16S rRNA分析等方法对从油桐饼粕中筛选出的蛋白质降解菌株LYT-1进行鉴定，并对该菌的促生长特性和抑制其他植物病原菌的抑菌谱进行测定，以期为油桐粕生产多功能生物有机肥以及其他植物病害的防治提供生物资源。

1 试验地概况

试验地为省部共建木本油料资源利用国家重点实验室，位于湖南省长沙市湖南省林业科学院内。

2 材料与方法

2.1 试验材料

菌株LYT-1由湖南省林业科学院和中南林业科技大学从湖南国盛生物能源股份有限公司提供的油桐粕中分离所得。油茶炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、亚麻立枯病菌 （Rhizoctonia solani）、黄瓜枯萎病菌 （Fusarium oxysporum sp.cucumebrium Owen）、油菜菌核病菌（Sclerotinia scleratiorum）、亚麻炭疽病菌 （Colletotrichum linicolum）5种供试菌株由中国农业科学院麻类研究所提供。培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、营养琼脂培养基（NA）［10］、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、解磷培养基（NBRIP）、油桐粕发酵培养基。

2.2 研究方法

2.2.1 试验设计

病害拮抗试验设计如下：用直径5 mm的打孔器打取油茶炭疽病菌、亚麻立枯病菌、油菜菌核病菌、亚麻炭疽病菌和黄瓜枯萎病菌菌饼分别种于装有PDA培养基板的平中心，在距离中心点2.5 cm处等距离点种LYT-1菌，以单独接种5种病原菌为对照，置于25℃恒温培养箱倒置培养，待对照组菌落长满全皿时，测量每个病原菌的抑菌圈直径，每个处理重复3次。

2.2.2 指标测定与方法

（1）菌落形态观察

LYT-1菌形态学鉴定方法如下：将菌种接种到NA培养基上，30℃培养1 d后，观察菌落表面形态、生长形状、透明度等。

（2）生理生化指标测定

革兰氏染色、接触酶测定、氧化酶测定、硝酸盐还原测定、柠檬酸盐利用、甲基红测定、V-P试验、淀粉水解测定、产硫化氢测定、丙二酸盐利用、明胶液化实验、卵磷脂酶活性测定等试验方法均参照《常见细菌系统鉴定手册》［11］。

（3）16S rRNA分子鉴定

将菌株用NA液体培养基培养24 h，10 000 r·min-1离心收集菌体，用试剂盒提取总基因组DNA，采用细菌通用引物 16SF （5＇-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3＇）和16SR（5＇-AGGTTACCTTGT TACGACTT-3＇）扩增LYT-1菌16S rRNA基因片段。PCR产物委托北京上海生工生物工程有限公司进行测序，获得序列在GenBank中进行BLAST同源性比较分析，采用MEGA 6.0软件Neighborjoining方法构建菌株系统发育树，确定该菌株分类的地位。

（4）蛋白质降解能力检测

将菌株LYT-1接种至液体的NA培养基，30℃、180 r·min-1培养至对数期（OD6001.0左右）后，以1% （v／v）接种比率将菌液接种至桐粕发酵培养基中，于30℃、180 r·min-1培养，每隔24 h取样进行氨基态氮的测定［12］。

（5）产IAA（吲哚乙酸）检测

将LYT-1接种到不含L-色氨酸和含0.5 mmol·L-1L-色氨酸的液体培养基（TSB）中，以空白液体培养基（TSB）为对照，置于30℃摇床培养，48 h后各取菌悬液2 mL，10 000 r·min-1离心10min，取上清液，按2mL·mL-1添加Salkowski试剂，室温避光静置30 min后，观察上清液颜色，颜色变成粉色者表示能够产IAA。

（6）产氨能力检测

将菌株LYT-1接种到装有蛋白胨培养液的试管中，30℃震荡培养3 d，每个试管滴加5滴纳氏试剂，如培养液中出黄褐色沉淀者表示能够产生氨。

（7）解磷能力检测

在2%琼脂的解磷培养基（NBRIP）上接种菌株LYT-1，在30℃下培养3 d后，观察菌落周围无色透明圈，以检测该菌溶解磷的能力。

2.2.3 数据统计与分析

采用Origin 2018软件进行数据统计与分析。

3 结果与分析

3.1 菌株LYT-1形态学鉴定

油桐粕蛋白质降解菌LYT-1在营养琼脂培养基（NA）培养24 h后形成圆形或椭圆形菌落，表面粗糙，污白色不透明（见图1-A）。用显微镜观察革兰氏染色后的菌株LYT-1，发现菌体为直杆状，两端钝圆，呈紫色（见图1-B），确定为革兰氏阳性菌。经芽孢染色显微观察发现有芽孢产生（见图1-C），符合芽孢杆菌属 （Bacillus）特征。

3.2 菌株LYT-1生理生化特征

LYT-1菌株的生理生化特征测定结果如表1所示。该菌株能够降解无机磷和纤维素，明胶液化和硝酸盐还原反应结果呈阳性，但柠檬酸利用和丙二酸利用为阴性。

3.3 菌株LYT-1的16S rRNA的系统发育树分析

对菌株LYT-1的16S rRNA基因片段进行PCR扩增，获得1 327 bp的目标条带，将测序结果在GenBank上进行BLAST比对分析，并以同源性较高的序列作为参考，构建系统发育树，如图2所示。经系统发育树分析，菌株LYT-1（NCBI登录号为KY626046）与枯草芽孢杆菌（NCBI登录号为KP696781.1）聚为一支，相似度达到99%，确定LYT-1菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

图2 菌株LYT-1菌株的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain LYT-1

3.4 菌株LYT-1的蛋白质降解能力

为了证实菌株LYT-1具有降解桐粕蛋白质的性能，对菌株LYT-1发酵桐粕过程中氨基态氮的含量进行了检测，结果如图3所示。

图3 菌株LYT-1发酵桐粕过程中的氨基态氮含量的变化Fig.3 Changes of am ino nitrogen content in tung cake fermented by strain LYT-1

菌株LYT-1发酵过程中产生较高含量的氨基态氮，发酵10 d后，溶液中的氨基态氮含量可达44.1 mg·g-1，表明该菌具有较强的降解桐粕粗蛋白成氨基酸的能力。

3.5 菌株LYT-1促生长特性

对菌株LYT-1进行促生潜力测量，结果如图4所示。菌株LYT-1在NBRIP培养基上有明显的透明圈（见图4A），表明其具备解磷能力。在与Salkowski’s比色液结合后，菌株LYT-1的菌液未呈现出颜色变化 （见图4B），表明其没有分泌IAA。加纳氏试剂后，菌株LYT-1蛋白胨培养液未呈现黄褐色沉淀（见图4C），表明其没有产氨。

图4 菌株LYT-1的解磷（A）、产IAA（B）和产氨（C）的特性Fig.4 Characteristics of strain LYT-1 for phosphorus（A），IAA（B）and ammonia（C）production

3.6 菌株LYT-1拮抗特性

菌株LYT-1对5种供试病原菌的抑制效果表现程度均不相同（见图5和表2）。图5、表2结果显示，菌株LYT-1对油菜菌核病原菌无抑制效果，而对亚麻立枯病菌、亚麻炭疽病菌、黄瓜枯萎病菌及油茶炭疽病菌具有较强的抑制作用，其中对黄瓜枯萎病菌和亚麻炭疽病菌抑制效果最显著，抑菌圈直径分别为21.6 mm和18.6 mm；对油茶炭疽病菌的抑制作用较弱，抑菌圈直径为8.2 mm；表明其具有较广谱的抑菌能力，开发潜力较大。

表2 菌株LYT-1对植物病原真菌的拮抗作用Tab.2 Antagonistic effect of LYT-1 against the phytopathogens

图5 菌株LYT-1对5种病原真菌的抑菌作用Fig.5 Antagonistic effect of strain LYT-1 against the phytopathogens

4 结论与讨论

油桐粕肥料化是油桐资源高值化利用的有效途径之一。利用具有促生长和生防功能的菌株发酵生产出的生物有机肥既可以改良土壤、供肥和保水等，又有促进植物生长和抑制有害病菌生长的作用［13］。多功能微生物资源的获得成为了生产高品质生物有机肥的关键。枯草芽孢杆菌的生长过程可高效产生脂肪酶、蛋白酶、黑芥子酶和淀粉酶等生物酶，在芽孢形成过程中又可产生多种抗生素［14-17］。熊川等［18］通过16S rRNA基因序列获得了高效降解菜籽饼粕中硫苷C1的菌株，该菌株可以高效分泌黑芥子酶。蔡学清等［19］通过对辣椒内生枯草芽孢杆菌Bs-2的研究发现，Bs-2对辣椒苗的促生作用明显，还可以诱导辣椒体内吲哚乙酸等促生长激素含量的提高，并降低脱落酸等激素的形成。周勇［20］对添加了外源菌剂枯草芽孢杆菌ACCC-10619的猪粪堆肥腐熟度进行了研究，结果显示其不仅大大缩短了发酵周期，并且都达到了完全腐熟的程度，说明该枯草芽孢杆菌能够有效降解有机质并加速堆肥进程。本研究通过菌落形态、生理生化和16S rRNA分析，发现菌株LYT-1也是具有高效降解油桐蛋白质和解磷能力的枯草芽孢杆菌，其对黄瓜枯萎病菌和亚麻炭疽病菌抑制效果最显著，是生产富含氨基酸的多功能生物菌肥的理想生物资源。