适用于转录组测序的灰毡毛忍冬体胚总RNA提取方法筛选

乔中全, 王晓明, 陈建军, 曾慧杰, 李永欣, 蔡 能

(湖南省林业科学院， 湖南 长沙 410004)

适用于转录组测序的灰毡毛忍冬体胚总RNA提取方法筛选

乔中全, 王晓明, 陈建军, 曾慧杰, 李永欣, 蔡 能

(湖南省林业科学院， 湖南 长沙 410004)

为了找到适用于转录组测序要求的灰毡毛忍冬体胚总 RNA 的提取方法，以体胚发育过程中的球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚为实验材料，比较分析了EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒法、RNA Cleanup Kit试剂盒法及改良 CTAB 法3种方法的 RNA 提取效果。结果表明： 改良 CTAB 法提取的RNA浓度较低，提取过程中发生降解；RNA Cleanup Kit试剂盒法提取的RNA完整性较差，RIN值没能达到转录组测序的要求。EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒法提取的RNA质量最高，且完整性好，能够满足转录组测序的要求。

灰毡毛忍冬； 体胚； RNA提取； 转录组测序

灰毡毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.)，为忍冬科忍冬属植物，是我国传统中药材之一，具有抗衰老、抗病毒、清热、消炎、保肝等生物学活性作用[1-3]。已被广泛应用于制药、保健品、化妆品、饮料等领域[4]。近年来有关灰毡毛忍冬的研究多集中在新品种选育、快繁技术、高效栽培技术等方面，关于其分子生物学方面的研究报道较少。

目前关于植物总 RNA 提取方法的报道比较多，但是不同植物或同一植物的不同组织采用的RNA提取方法未必相同，同一种方法不一定具有通用性。因此，要根据具体的植物或器组织探索适宜的RNA 提取方法[5-7]。灰毡毛忍冬体胚中含有大量的多酚和多糖等次生代谢产物，并且组织内富含RNase，RNA极易被分离降解，给灰毡毛忍冬RNA的提纯带来许多困难。

目前针对适用于灰毡毛忍冬体胚发育过程不同阶段转录组测序的 RNA 提取方法尚未见报道。基于此，本研究采用3 种方法对球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚进行总 RNA 提取，并对提取的RNA 质量进行比较分析，为筛选出适用于转录组测序的灰毡毛忍冬体胚总 RNA 提取方法的建立提供基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

试验用材料为灰毡毛忍冬的不同发育阶段体胚，即：球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚。取样品后迅速装入灭菌的RNase-free 离心管中，置于液氮中保存。

1.2 总RNA提取方法

采用三种总RNA提取方法提取灰毡毛忍冬体胚总RNA，方法1： EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒法；方法2： RNA Cleanup Kit试剂盒法；方法3：改良的CTAB法。方法3主要做以下改良： ①在加液氮研磨样品前加入PVP。②将研磨好的样品加入到65℃预热好的CTAB提取液中，加2%的巯基乙醇。65 ℃水浴中温浴30 min，在此期间用手轻轻摇晃6次。③水浴后冷却至室温，12 000 r/min，离心10 min。④取上清，加等体积的氯仿/异戊醇(24/1)，混匀后静置10 min，12 000 r/min，离心10 min。⑤取上清，加1/10体积的5 mol/L的NaAc，加2/3体积的异丙醇，-20 ℃沉淀1 h。⑥4 ℃、12 000 r/min，离心10 min。⑦70%的酒精清洗2次，自然晾干，溶解。⑧加DNase水解DNA。

1.3 RNA质量检测

用1.5%琼脂糖凝胶电泳初步检测 RNA条带的清晰度和完整性，采用Agilent 2100检测28S/18S值及RNA的纯度和浓度。

2 结果与分析

2.1 RNA电泳结果分析

由图1可以看出，3种方法提取的RNA都能看到28S和18S两条带，但是方法3提取的RNA条带不明亮，说明该方法提取的RNA浓度较低、完整性较差。用方法2提取的RNA条带较清晰，28S的亮度比18S高，明显好于方法3，但有轻微的拖尾现象；方法1提取的RNA条带无拖尾、弥散现象，28S和18S两条带明亮且亮度比约为2∶1，说明其完整性好。

注:由左向右依次为EASYspinPlus植物RNA快速提取试剂盒法、RNACleanupKit试剂盒法、改良CTAB法。图1 3种不同方法提取的RNA电泳结果Fig.1 TheextractionresultsofRNAelectrophoreticof3differentmethods

2.2 RNA质量及浓度分析

从表1可以看出，3种方法提取的 RNA OD260/OD280值为2.12～2.19、OD260/OD230值为1.96～2.26，说明采用这3种方法提取的RNA纯度较好，没有污染，都能达到后续试验的要求。用方法3提取的球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚RNA 浓度较低，分别为335、267、282和298；RIN 值分别为 4.8、4.3、5.2和5.7，28S/18S值为1.6、1.7、1.5和1.6，说明 RNA 降解严重，完整性差。用方法2提取的 RNA 浓度较高，分别为423、446、459和492；28S/18S值 1.8、1.7、1.5和1.6；RIN值分别为 6.5、6.3、6.4和6.4，略低于转录组测序要求。方法1提取的 RNA 浓度分别为741、762、759和737；28S/18S值分别为 1.9、1.9、1.8和1.7，RIN值分别为9.8、9.8、9.5和9.5，在质量上完全能够达到文库构建和转录组测序的要求。

表1 不同提取方法对灰毡毛忍冬体胚总RNA提取结果比较Tab.1 ComparisonofthetotalRNAsextractedfromdifferentsomaticembryosofLoniceramacranthoidesHand.-Mazz.withdifferentmethods提取方法体胚阶段RNA浓度(ng/μL)OD260/OD280OD260/OD230RIN值28S/18S球形胚7412.182.219.81.9心形胚7622.152.269.81.9EASYspinPlus植物RNA快速提取试剂盒法鱼雷胚7592.162.039.51.8子叶胚7372.152.089.31.7球形胚4232.182.026.51.8心形胚4462.182.166.31.8RNACleanupKit试剂盒法鱼雷胚4592.191.966.41.7子叶胚4922.162.056.41.5球形胚3352.172.094.81.6心形胚2672.182.074.31.7改良CTAB法鱼雷胚2822.192.065.21.5子叶胚2982.122.125.71.6

3 结论与讨论

不管是高通量测序，还是RT — PCR等分子生物学实验，提取得到质量高的RNA是实验的前提和基础[8]。目前，有关植物总RNA提取方法的报道已经很多，但不同RNA提取方法具有各自的优缺点，不同方法适用于不同的植物，即使同一种植物的不同组织适宜的方法也不尽相同[9-12]。植物转录组测序对样本总RNA的质量要求非常高，要求RNA总量≥20ng、浓度≥500ng/μL、OD260/OD280为1.8～2.2、OD260/OD230>1.9、RIN≥7、28S/18S>1.0，因此，找到一种能够满足转录组测序质量要求的RNA提取方法非常重要。灰毡毛忍冬体胚中含有大量的酚类和多糖物质，酚类物质在RNA提取过程中极易发生褐化反应，被氧化成醌类化合物不可逆的与RNA结合，致使提取到的RNA质量非常差，所以在实验过程中必须要有效的去除组织中的多糖及酚类物质，才能得到高质量的RNA，满足转录组测序的需要[13-15]。

本研究以灰毡毛忍冬体胚发育过程中的4个阶段为实验材料，采用EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒法、RNA Cleanup Kit试剂盒法和改良的CTAB法分别提取球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚总RNA，并对3种提取方法的效果进行了分析。3种方法提取的 RNA 的OD260/OD280和OD260/OD230都符合要求，说明采用这3种方法提取的RNA纯度较好，没有污染。方法3提取的RNA浓度较低，提取过程中发生降解；方法2提取的RNA完整性较差，RIN值没能达到转录组测序的要求。方法1提取的RNA各方面均能达到转录组测序的要求。

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ScreeningofmethodstoextracttotalRNAfrommicro-sporeofsomaticembryosofLoniceramacranthoidesHand.-Mazzfortranscriptomesequencing

QIAO Zhongquan, CHEN Jianjun, WANG Xiaoming, ZENG Huijie, LI Yongxin, CAI Neng

(Hunan Academy of Forestry，Changsha 410004，China)

In order to find out micro-spore extracting method suitable for transcriptome sequencing，this study took somatic embryos ofLoniceramacranthoidesHand.-Mazz. as experimental material and micro-spore induced with globular embryo, heart shaped embryo, torpedo embryo and embryo as research object. This study compared and analyzed the RNA extraction effects by 3 different methods：EASYspin Plus method, RNA Cleanup Kit method, improved CTAB method. The results showed that RNA concentrations extracted by improved CTAB method were lower，and degradationappearedinextraction process. Integrity of RNA extracted by RNA Cleanup Kit method was bad，and the RIN value did not meet the requirements of transcriptome sequencing．Quality of RNA extracted by EASYspin Plus method was the highest，and the RNA integrity was also good．Therefore，RNA obtained by this method was suitable for satisfying the requirement of transcriptome sequencing．

LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.； somatic embryos； RNA extraction； transcriptome sequencing

2015-09-07

湖南省科学技术厅科技计划重点项目：金银花体胚发生的分子基础与再生研究(2012FJ2011)。

乔中全(1985-)，男，山东省曹县人，研究实习员，主要从事林木遗传育种、栽培及生物技术研究。

Q 949.781.2

A

1003 — 5710(2015)06 — 0099 — 03

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2015. 06. 019

(文字编校：杨 骏)