龙须草叶片电镜扫描样品制备方法及扫描电镜下电压选择

罗毅文, 乔匿骎, 周仁杰, 朱育锋, 喻夜兰

(湖南农业大学东方科技学院， 湖南 长沙 410128)

龙须草叶片电镜扫描样品制备方法及扫描电镜下电压选择

罗毅文, 乔匿骎, 周仁杰, 朱育锋, 喻夜兰*

(湖南农业大学东方科技学院， 湖南 长沙 410128)

探讨了龙须草叶片扫描电镜样品的制备技术以及扫描电镜下电压的选择。结果表明: 取叶组织直接镀金观察的效果与通过戊二醛固定经丙醇脱水后再镀金观察的效果相差不大，研究龙须草叶片结构可以用直接制片法。为了获得清晰的龙须草叶片扫描电镜图，在扫描电镜下选择用10 kV的电压为最佳。

龙须草; 叶; 扫描电镜

龙须草(EulaliopsisbinataRetz.)是一种多年生的野生草本植物，属禾本科(Gramineae)拟金茅属(EulaliopsisHonda.)，多生长在海拔2600m以下的丘陵、山地[1-2]。龙须草具良好的生态效益，是一种优良的水土保持先锋草种，分蘖能力强，生长速度快，根系发达，叶狭长披覆地表，有效地减少了雨水对地表的冲刷[3-4]；龙须草对土壤重金属有着良好的吸附作用，有研究发现随着Pb、Cd复合污染含量的升高,龙须草的光合综合指标下降幅度较小,说明龙须草对重金属复合污染具有较强的耐性,且Cd对龙须草的影响大于Pb[5-6]。同时，龙须草有着良好的经济效益，有报道称四川青龙山村26余hm2的龙须草种植规模，年产值在200～400 t之间，每年最少能带来20万元的经济收入[7]。龙须草最具经济价值的部分是其叶，叶片中纤维含量高，韧度高、拉力强和防潮性能好，在生产实践中常用来织绳、编织、造纸及纺织[8]。刘金祥等[1]综合前人研究发现龙须草能全部代替树木造纸，木质素含量低，纤维素含量高，且纤维细长质韧，易成浆，易漂白，成品的质量指标介于针叶木浆与阔叶木浆之间，并且适用于规模化生产。曲丽君等[9]对龙须草纤维的细度、回潮率及力学性能进行了测试，发现龙须草纤维断裂强力可达到65.58 cN，回潮率为6.99%，可以满足纺纱工艺的要求。扫描电子显微镜是许多学科在形态学研究中进行显微观测的重要工具，它的突出优势除了具有可实现对观察材料的放大倍数可调范围宽、视野大、景深长和立体感强等之外，还具有极高的分辨率，是观察物体表面超微结构的最有效工具，在诸多学科中得到了广泛应用[10-11]。利用扫描电镜观察龙须草叶片纤维的结构具有十分重要的意义。本文对龙须草电镜样品制备及观察进行了研究，以期为龙须草电镜实验提供技术支持。

1 材料与方法

1.1试验材料

试验用的龙须草来自湖南农业大学耘园实验基地龙须草种质资源实验地。取样的种质资源来源于广东连州的龙须草种，叶片取自成熟新鲜叶片的倒三叶，用刷子将叶片上的杂质去除掉，取2 mm×2 mm左右的中部叶脉的样品作为试验材料。

1.2试验方法

取相同部分的叶片样，一种是将叶片直接切片法制片，一种是采用戊二醛固定法制片，比较两种制片方法的电镜效果。直接切片法是用锋利的小刀将样品从叶片中部叶脉处切下来后，直接放在真空镀膜机内，把金喷镀到样品表面后，取出样品在扫描电子显微镜下观察照相；戊二醛固定法是将叶片预取样处放在滴有一滴预冷固定液的洁净蜡版上，用两片新的、锋利的刀片成“拉锯式”将叶片组织切下并修小，接着用牙签将叶样品块移至盛有冷的固定液的小瓶中。然后用2.5%戊二醛固定2 h，再用1%锇酸固定液固定2 h，最后用缓冲液漂洗20 min完成固定。固定后的样品依次经过70%、80%、90%丙酮各25 min，再经过2次100%丙酮30 min系列脱水，将样品置于临界点干燥器中，浸泡于液态二氧化碳中，加热到临界点温度以上，使之气化进行干燥。干燥后的样品将其放在真空镀膜机内，把金喷镀到样品表面后，取出样品在扫描电镜中进行观察[12]。

在电镜下进行观察，电压的大小也会影响到成像的效果，本实验对戊二醛固定法的制片分别用5、10、20 kV的电压进行观察。

实验用的仪器为日本电子株式会社JSM-6380LV型扫描电镜。

2 结果与分析

2.1不同制片方法的扫描电镜图像比较

将两种不同制片法扫描电镜下的显示在图1中。从图1中可以看出，观察的叶片上表皮放大倍数从500倍、1000倍、2000倍到5000倍，直接切片法和戊二醛固定法都比较清楚，两者差别不是很大。对比清晰度，戊二醛固定略要清晰一些。如果是用来统计气孔数，测量细胞长短，直接切片的电镜观察能够达到要求。从节约实验成本上和节省实验时间上，龙须草叶片的扫描电镜实验完全可以用直接切片不经固定脱水来进行。

2.2不同电压下的扫描电镜图像比较

图2为不同电压下的扫描电镜观察比较图。从图2中可以看出用5 kV观察，图像较清晰，但视野有点暗。用20 kV观察时图像暗，且边缘较模糊，图像不太清晰。用10 kV观察，图像清晰，轮廓分明，光线明亮，适合观察。因此，观察龙须草叶片切片时，扫描电镜适合用10 kV的电压进行观察。

观测指标直接切片戊二醛固定叶片上表皮放大500倍图1 2种制片方法的扫描电镜图像比较Fig.1 ComparisonofimageproductionoftwokindofSEM

观测指标直接切片戊二醛固定叶片上表皮放大1000倍叶片上表皮气孔放大2000倍叶片上表皮蜡质放大2000倍续图1 2种制片方法的扫描电镜图像比较CoutinuedFig.1 ComparisonofimageproductionoftwokindofSEM

图2 3种电压下的扫描电镜图像比较Fig.2 ComparisonofimageproductionofthreekindofvoltageofSEM

3 结论与讨论

生物组织从生物活体取下以后，如果不立即进行适当处理，由于细胞内部各种酶的作用，会出现细胞自溶现象。此外，还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏[13-14]。因此，为了使细胞结构尽可能保持生前状态，操作时必须做到快、小、准、冷。一般要求动作迅速，取材后在最短时间内投入2.5%戊二醛固定液。龙须草叶片水分含量低，叶表面的蜡质覆盖，取样不经过戊二醛固定后，直接镀金观察的效果并不比通过固定、脱水后再镀金观察的效果差很多。因此当实验较多的时候，可以采用直接切片观察。

龙须草叶片有一定硬度，特别是中间的叶脉较厚，切片较难切入，一定要保证刀片锋利，动作要迅速，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。

在JSM-6380 LV型扫描电镜下观察龙须草切片，选择用10 kV的电压较适合观察。

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PreparationofEulaliopsisbinatabladeandchooseofvoltageforscanningelectronmicroscope(SEM)

LUO Yiwen， QIAO Niqin， ZHOU Renjie， ZHU Yufeng， YU Yelan*

(Orient Science and Technology College， Hunan Agricultural Uniersity，Changsha, 410128， China)

The SEM sample preparation technique ofEulaliopsisbinatablade and scanning electron microscope voltage selection were studied. The results showed: the observation effect of blade tissue by directly gold plating was not very different from blade tissue by glutaraldehyde fixing and alcohol dehydration and gold plating， most of the blade structure studing can be used to the method of directly gold plating. The 10KV was the best choice to observe blade structure which can get more clear picture.

Eulaliopsisbinata； blade； SEM

2014-12-16

湖南省大学生创新性实验计划项目《不同生态型龙须草叶片纤维解剖结构比较研究》(53020620)；国家林木种质资源平台项目(2013DKA210003-02-13)。

* 为通讯作者

S 543.9

A

1003-5710(2015)02-0072-04

10. 3969/j. issn. 1003-5710. 2015. 02. 018

(文字编校：龚玉子)