对虾海水池塘养殖固形废弃物集污效率以及尾水处理研究

刘旭佳,何绪刚,赖俊翔,黄国强,侯 杰

(1 广西科学院,广西海洋科学院,广西近海海洋环境科学重点实验室,广西 南宁 530007;2 华中农业大学水产学院,湖北 武汉 430070;3 广西海洋研究所有限责任公司,广西 北海 536000;4 北部湾海洋产业研究院,广西 防城港 538000;5 广西中医药大学海洋药物研究院,广西 南宁 530200)

对虾池塘养殖污染问题是由高密度养殖与大量投饲引起的,在饲料输入中,14.5%～28.7%氮和7.5%～16.5%磷转化为对虾生物量,而其余以非可溶性与可溶性状态留在养殖系统中,最终直接外排[1-2]。如果不进行有效处理,有机富集沉积物中的氮超过了养殖系统的净化能力,可能会通过含氮化合物(如氨和亚硝酸盐)的积累导致水质恶化,对对虾健康生长产生负面影响。对虾海水养殖池塘面临的水质污染、病害滋生与水产品安全三大问题,三者之间相互关联,最根本的原因是养殖池塘生态环境受到破坏,继而诱发疾病,病害频发致使药物滥用,最终导致质量安全问题。这些问题由池塘养殖模式产生的,因此修复池塘养殖环境、创新养殖模式才是解决对虾池塘养殖问题的关键所在。对虾养殖过程中产生大量废弃物未经任何处理直接外排导致的生态环境问题,已经引起全世界范围内越来越多的关注[2-4]。

随着中国环保政策持续高压,池塘养殖尾水生态处理必将成为今后池塘健康养殖的亟需技术。国内外研究人员一直将微生物系统处理作为循环水养殖或者尾水处理的核心[5]。养殖实践表明,固形废弃物高效收集与利用是养殖系统与尾水处理的首要关键问题[6-8],国内外工厂化循环水养殖一般采用弧形筛或者颗粒物分离器通过不断反冲洗去除固形废弃物[5],但并未进行收集再利用,本质上是一种将面源污染变为点源污染的处理方式。因此,固形废弃物集污效率是零排放养殖系统与模式的重要研究内容。人工湿地作为一种生态友好、效率高、成本低、操作简单的尾水处理工艺,可以高效去除养殖尾水中氮磷[9-11]。目前,人工湿地在海水池塘养殖废水处理研究还处于起步探索阶段[12-13]。本试验参照垂直流人工湿地工艺,采用上向折流式布局,研究三级上向垂直流处理桶中基质填料以及微生物对养殖尾水处理效果。

研究了对虾海水池塘养殖固形废弃物集污效率以及三级上向垂直流尾水处理技术,以期为对虾池塘养殖环境修复技术提供新的思路和解决方案,为中国海水对虾池塘健康养殖可持续发展提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 集污沉淀塔与尾水处理原理

1.2 试验设计

(1)固形废弃物集污效率

在广西北海市合浦县闸口镇选择3个养殖场,池塘养殖面积、投苗数量、苗种规格、养殖周期、养成规格、养殖产量以及存活率见表1,表1为2020年3个养殖场第一茬的养殖情况。

表1 3个对虾养殖场的基本情况Tab.1 Basic situation of three shrimp breeding experiment farms

养殖前先进行虾塘改造,将虾塘底部改为锅底状,开挖底部预埋集污管,池塘中央铺设集污管道(PVC材质),直径110 mm,管道终端与相同孔径的集污管道相连,管道从虾塘底部延伸至沉淀塔,由4 kW真空泵进行吸污,底部铺设黑膜。3个试验池塘均配置2个沉淀塔,沉淀塔架设在虾塘陆基岸上(具体参数见图2),沉淀塔底部为锥形,设置开关阀,用于固形废弃物定时排出与收集,计算不同养殖阶段固形废弃物的集污效率。

图2 沉淀塔(左)与处理桶(右)的具体参数 Fig.2 Specific parameters of sedimentation tower(left)and processing bucket(right)

(2)三级上向垂直流尾水处理试验

沉淀塔出口(进三级处理桶之前)需要增加一个三通(出水阀门)。尾水处理系统运行时间是2020年6月20日,三级处理桶毛刷进行自然挂膜,在8月20日将一级处理桶进行充气,溶氧(DO)保持在1.5 mg/L左右,二级处理桶不曝气,三级处理桶曝气,DO保持在5 mg/L左右。

(3)对虾饲料表观消化率试验

计算对虾养殖产生固形废弃物集污效率涉及对虾饲料表观化率,因此在室内开展对虾饲料表观消化率试验。

饲料制作:购买广东海大南美白对虾商品饲料,选用粒径为1.2 mm、1.6 mm、2.0 mm的0号料各5 kg,粉碎后过60 目筛,按0.1%含量加三氧化二钇(Y2O3),边加水边搅拌,混合均匀后制粒。压制成相应粒径的颗粒饲料,风干后放入-20 ℃冰箱中保存待用。

养虾管理:2020年6月5日,选择粤海虾苗0.5万尾,规格0.02 g/尾,在广西科学院、广西海洋研究所竹林海水增养殖基地D2栋车间进行暂养,养殖5 d后,分出规格均匀200尾进行表观消化率试验。试验装置为PVC箱,数量10个,体积为120 L(50 cm×40 cm×60 cm),每日分别07:00,11:00和17:00进行饱食投喂,饲料量分别占日投喂量的40 %、20 %、40 %。对虾养殖至8月18日,共74 d。试验期间海水盐度29～31,pH7.9～8.1,DO保持在5.0 mg/L,光照周期为自然光照周期,约14L∶10D。养殖期间,PVC箱用1 cm网眼的网片遮盖以防止其跳出。

1.3 样品收集与处理

(1)集污样品的采集

在3个养殖场,养殖期间每20 d连续抽取污水3次,污水以抽污时出水口的污水变清澈时为准,记录抽入沉淀塔污水的总体积。将底层沉积物全部取出,搅拌均匀后用1 L的采水器取3个样品,分别置于1 L的锥形瓶中静置4 h,完全沉淀后用虹吸法抽取上清液作为废水样品。将底层的沉淀物倒入玻璃皿中,60 ℃烘干称重,冷藏待测,记录固形废弃物总干重。

(2)三级上向垂直流处理桶尾水样品收集

(3)毛刷细菌样品收集

在C养殖场,8月1日分别在三级处理桶取样,剪刀用75 %乙醇消毒,剪取少量毛刷。样品未经曝气增氧的分别标记为B1、B2、B3。9月21日再次在三级处理桶取样,标记为B4、B5、B6。所有样品采集后立即放入液氮中保存。

(4)对虾饲料表观消化率粪便样品的采集

用添加0.1 % Y2O3虾料投喂,每20 d连续5 d收集粪便与残饲。采用虹吸法收集粪便与残饲于烧杯中,60 ℃烘干后冷藏待测。

1.4 样品测定

(1)集污效率测定

集污效率包括固形废弃物以及总氮(TN)集污效率,固形废弃物集污效率为沉淀塔收集固形废弃物的总量与用对虾表观消化率计算产生固形废弃物总量的比值;TN集污效率为沉淀塔收集TN含量与用对虾对饲料TN表观消化率计算产生TN含量的比值。沉淀塔收集的TN由固形废弃物中的TN和溶解在水体中的TN组成。表观消化率按照水产动物表观消化率测定方法[14];饲料、粪便和固形物TN采用元素分析仪VarioEL III CHONS analyzer(Elementar Analysensysteme GmbH,Germany);三氧化二钇(Y2O3)采用离子体发射光谱仪(IVAO200,Singpore),消化法测定钇含量。水中TN含量测定采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法[15]。

(2)集污效率计算

① 对虾对饲料的表观消化率计算公式为:

(1)

式中:D是对虾对饲料的表观消化率;Md是饲料中Y2O3百分含量;Mf是粪便中Y2O3含量。

② 对虾对饲料TN的表观消化率的计算公式为:

(2)

式中:Dd是对虾对饲料TN的表观消化率;Nf是粪便中TN的百分含量;Nd是饲料中TN的百分含量;Md是饲料中Y2O3百分含量;Mf是粪便中Y2O3百分含量。

③ 固形废弃物集污效率的计算公式为:

(3)

式中:ωs是固形废弃物集污效率;Ms是收集的固形废弃物总质量(kg);Mf是投喂饲料质量(kg);D是对虾对饲料的表观消化率。

④ TN集污效率的计算公式为:

(4)

式中:ωN是集污装置对总氮的集污效率;Ns是收集的固形废弃物中总氮含量(g);Nd是排污溶解于废水中的总氮含量(g);Nf是投喂饲料中总氮含量(g);Dd是对虾对饲料中氮的表观消化率。

(3)尾水水质指标测定

(4)生物毛刷细菌样品分析

将每个样品剪碎,用E.Z.N.A Water DNA Extraction Kit试剂盒(Omega Bio-Tek,USA)提取DNA。对16S rDNA基因可变区V3～V4区进行PCR扩增,所用引物序列为细菌特异性引物:341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测,送百迈克生物信息公司(北京)进行基于Illumina HiSeq 2500测序平台,利用双末端测序的方法,构建小片段文库进行测序。

1.5 数据分析

所有结果数据以平均值±标准差表示。数据采用Excel与SPSS 20.0软件进行统计与分析,不同试验组比较采用单因子方差分析,P<0.05认为差异显著。

首先使用Trimmomatic v0.33软件,对测序得到的 Raw Reads进行过滤;然后使用Cutadapt 1.9.1软件进行引物序列的识别与去除,得到不包含引物序列的高质量Reads;使用Flash v1.2.7软件,通过overlap对每个样品高质量的 Reads 进行拼接,得到的拼接序列即Clean Reads;使用 UCHIME v4.2软件,鉴定并去除嵌合体序列,得到最终有效数据(Effective Reads)。使用Usearch软件对Reads在97.0%的相似度水平下进行聚类、获得OTU。以SILVA为参考数据库使用朴素贝叶斯分类器对特征序列进行分类学注释,得到每个特征对应的物种分类信息。

2 结果与分析

2.1 集污效率

经测定,不同养殖时期对虾对饲料的表观消化率分别为80.9%±0.4%、81.0%±0.2%、81.3%±0.6%,且不同时期表观消化率间无显著差异(P>0.05);对虾对饲料TN表观消化率分别为83.8%±0.3%、84.7%±1.2%、89.6%±2.4%,不同养殖期间无显著差异(P>0.05)(表2)。

表2 对虾的表观消化率和集污效率Tab.2 White shrimp apparent digestibility and sewage efficiency

在3个养殖场对虾实际养殖生产中,C养殖场是从中培苗开始养殖,因此C养殖场只进行中期和后期固形废弃物集污率计算。根据集污效率计算公式得出:沉淀塔对固形废弃物集污效率分别为10.6%±1.8%、31.1%±5.7%、52.2%±5.2%,养殖前期、中期与后期固形废弃物集污效率差异显著(df=2,F=63.983,P=0.001),3个时期间差异均显著(P<0.05)。TN集污效率分别为1.4%±0.2%、3.4±0.6%、9.1±0.1%,养殖前期、中期与后期TN集污率差异显著(df=2,F=307.970,P=0.000),3个时期间差异均显著(P<0.05)(表2)。其中,养殖前期20 d取样时间点,是在次日早上收集前日产生固形废弃物,残饲与粪便等有机质经过长时间矿化分解,所以导致固形废弃物集污效率与TN集污率均较低。在中期21～50 d和后期51～70 d取样时,在第一次投喂前将虾塘底部固形废弃物全部抽出,然后再投喂,2 h后开始抽污。随着对虾规格生长,投喂量大幅增加,因此中后期对虾养殖固形废弃物集污效率与TN集污率显著增加(P<0.05)。

2.2 三级上向垂直流处理桶中溶氧变化

三级上向垂直流处理桶DO变化见图3。

图3 三级上向垂直流处理桶溶氧变化Fig.3 Change of dissolved oxygen content in the three-stage upward vertical flow processing bucket

6月20日至8月20日,选择C养殖场,将三级处理桶中生物毛刷进行自然挂膜,8月20日在一级处理桶和三级处理桶分别安装充气泵进行曝气增氧,至8月25日上清液、一级处理桶、二级处理桶、三级处理桶中DO含量分别在5.38～8.54 mg/L、0.34～3.31 mg/L、0.16～0.56 mg/L、0.31～4.05 mg/L范围。8月25日后三级处理桶中DO基本保持稳定,上清液与三级处理桶DO含量分别为5.00～7.38 mg/L、1.11～1.98 mg/L、0.27～0.45 mg/L、4.60～5.82 mg/L。

对虾池塘养殖过程中温度变化范围29.0～33.9℃,pH 7.89～9.04,盐度变化范围10.27～12.27。

2.3 三级上向垂直流处理桶尾水生物水质分析

图4 三级上向垂直流处理桶中总氮变化Fig.4 Change of total nitrogen content in three-stage upward vertical flow processing bucket

图5 三级上向垂直流处理桶中总磷变化Fig.5 Changes of total phosphorus content in three-stage upward vertical flow processing bucket

图6 三级上向垂直流处理桶氨氮变化Fig.6 Change of ammonia nitrogen content in three-stage upward vertical flow processing bucket

图7 三级上向垂直流处理桶亚硝酸盐氮变化Fig.7 Changes of nitrite nitrogen content in three-stage upward vertical flow processing bucket

图8 三级上向垂直流处理桶硝酸盐氮变化Fig.8 Changes of nitrate nitrogen content in three-stage upward vertical flow processing bucket

图9 三级上向垂直流处理桶无机磷变化Fig.9 Changes of inorganic phosphorus content in three-stage upward vertical flow processing bucket

2.4 三级上向垂直流处理桶中毛刷细菌多样性

高通量测序及其数据分析结果显示:三级处理桶B1、B2、B3与曝气增氧三级处理桶B4、B5、B6中毛刷细菌归属于 27 门类、63 纲、167 目、301 科、520 属、557种。表3是6个样品生物毛刷细菌门水平细菌组成结果,按丰度排序前十位分析高通量测序结果,各个样品在门水平、属水平的细菌结构组成基本相似。

表3 三级上向垂直流处理桶毛刷细菌门水平类群组成和比率Tab.3 Composition and proportion of bacterial phylum level of the biological brushin three-stage upward vertical flow processing bucket

一级处理桶B1(厌氧60 d)优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria),经过低氧曝气后,B4(厌氧60 d→低氧30 d)优势菌门为变形菌门、蓝藻门(Cyanobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi);二级处理桶B2(厌氧60 d)优势菌门为厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门(Bacteroidetes),二级处理桶B5(厌氧60 d→厌氧30 d后)优势菌门为厚壁菌门、变形菌门、放线菌门(Actinobacteria);三级处理桶B3(厌氧60 d)优势菌门为变形菌门、拟杆菌门、放线菌门,三级处理桶B6(厌氧60 d→高氧30 d)优势菌门为厚壁菌门、变形菌门、放线菌门。另外,还有浮霉菌门(Planctomycetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)。

三级处理桶硝化细菌类群和比率见表4。除样品B6外,其余样品均发现2个菌属氨氧化细菌(Ammonia oxidizing bacteria,AOB),主要是亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira),均属于变形菌门。除样品B4外,检测到一个亚硝酸盐氧化菌(Nitrite oxidizing bacteria,NOB)主要是硝化螺菌属(Nitrospira)。B3与B6样品硝化细菌丰度明显最高。

表4 三级上向垂直流处理桶中硝化细菌类群组成和比率Tab.4 Composition and proportion of nitrifying bacteria in three-stage upward vertical flow processing bucket

三级处理桶反硝化细菌类群和比率见表5。6个样品中共发现放线菌门2个菌属,厚壁菌门3个菌属,拟杆菌门1个菌属,变形菌门7个菌属的反硝化细菌。B1优势菌有芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、苍白杆菌(Ochrobactrum)等。B2优势菌为不动杆菌属(Acinetobacter)。B3优势菌为亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)。B4优势菌新出现固氮弧菌属(Azoarcus)。B5与B6优势菌丰度大幅降低。Anammox厌氧氨氧化菌属于浮霉菌门(Planctomycetes),与已有文献报道进行比对,三级处理桶生物毛刷未检测出。

3 讨论

3.1 集污效率

池塘养殖污染问题主要由养殖过程中固形废弃物沉积、矿化与分解引起的,而养殖固形废弃物则是高投饲养殖模式的必然产物。目前对虾池塘养殖的集污装置与效率的研究几乎是空白,可参考的文献资料非常少。本试验中养殖前期固形废弃物集污效率与TN集污效率较低(10.6%±1.8%、1.4%±0.2%),随着对虾生长与投喂量增加,可以提高到52.2%±5.2%、9.1±0.1%。分析集污效率整体偏低的原因,一是前期投饲量少,集污不及时,长时间的有机质矿化分解导致固形废弃物集污效率与TN集污效率均较低;二是对虾是底栖动物,在虾塘底部的活动扰动也会增加残饵与粪便的分解,减缓沉降[20];三是在开始虾塘底部改造时,养殖户只针对池塘中间位置,而不是整个池塘底部,导致集污面小、集污不彻底,这也是集污效率低的重要原因之一。养殖系统的集污效率与池底结构、池型结构直接相关,池底结构设定以切向射流形成池内二次流,且在池底中心设置排污口,这种结构最有利于固废排出。池型以圆弧角方形、八角形池最佳,兼具空间利用率高与流场特性优势[7]。赵乐等[21]对循环水养殖系统集污特性研究表明,射流速度固定时,40°左右射流角度的集污效果最好,采用底部抽污模式。此试验主要在室内开展,且养殖池面积小(长4.4 m、宽3.4 m),很难简单应用到0.33～0.53 hm2虾塘。因此,在池底结构、池型确定的基础数据上,研究符合对虾池塘底部具体结构参数是显著提高池塘养虾固形废弃物集污效率的关键。

3.2 三级上向垂直流处理桶尾水处理效果

3.3 三级上向垂直流处理桶中细菌群落结构

微生物是生物净化过程中的主要执行者,养殖废水中的有机碳、有机氮和有机磷的分解与转化主要靠微生物完成,因此研究处理桶中微生物群落结构与功能非常重要[29]。三级上向垂直流处理桶中变形菌门是6个样品中细菌丰度较高的共有菌门,含有多种代谢种类,大多数细菌兼性或专性厌氧及异养细菌,其主要功能是降解有机物[30-31]。本试验中,检测最多的是α-变性菌纲和γ-变性菌纲,亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)属于β-变性菌纲,可以氧化氨为亚硝酸的无机化能自养细菌,同时又具有反硝化能力。γ-变性菌纲包括一些反硝化菌,如假单胞菌属(Pseudomonas),在废水脱氮起重要作用。厚壁菌门在第二大优势菌,由于其细菌可以产生内生孢子,在极端环境中具有较强生存能力,常存在于废水处理系统[32]。

4 结论

通过“沉淀塔固废集污”+“三级上向垂直流处理桶”模式,对虾池塘养殖固形废弃物与总氮集污效率可以达到52.2% ±5.2%、9.1%±0.1%,尾水中总氮与氨氮去除率可以达到 45.5%、93.6%,实现对虾池塘养殖“零排放”。本研究较好地解决了传统对虾池塘养殖的污染问题,为对虾绿色健康养殖模式转型升级提供参考。