鲜活小龙虾超高压剥壳预处理工艺比较及对虾仁品质的影响

李彩璐 ,沈 建 ,欧阳杰 ,贺兴禹 ,马田田

(1 广东海洋大学食品科技学院,广东 湛江,524088;2 中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所,上海 200092)

小龙虾(Procambarusclarkia)是淡水螯虾的一种,其学名为克氏原螯虾[1]。2020年,中国的小龙虾养殖总面积约为145.7万hm2,其养殖总产量超过240万t[2]。小龙虾具有蛋白含量高、低脂肪且多为不饱和脂肪酸及部分脂溶性维生素含量大于大多数陆生动物的特点[3-4],深受人们的喜爱。

目前,小龙虾仍以鲜活销售为主,但加工产业还在不断扩大,究其原因主要有几点:1)小龙虾的产量不断增加;2)小龙虾的生产有较强的季节性;3)小龙虾的巨大产量无法在其大量上市的季节仅凭靠鲜活销售消耗完。综合三点原因可知,对小龙虾进行加工处理十分重要。现市场上出现了小龙虾肉酱、即食龙虾仁、冻生龙虾仁、虾糜等加工产品[5]。无论加工成何种产品,脱壳都是最重要的工序之一。

超高压技术(Highhydrostaticpressure,HHP)是一种对小分子物质(如风味物质和色素等)的天然结构影响较小且能有效地保持食品的风味和营养物质的非热加工技术[6]。现已有关于超高压技术用于促进甲壳类水产品脱壳方面的报道,如汪兰等[7]对小龙虾进行先水煮4 min后超高压处理,研究表明300 MPa、1 min处理后小龙虾脱壳效率提高了约65.5%。此外,虾仁还具有完整性好、硬度增加、耐嚼性变大等特点。Shao等[8]分别在100、200、300、400、500 MPa处理鲜活小龙虾5 min,表明超高压处理组的小龙虾得肉率高于对照组,脱壳虾仁的硬度、弹性和咀嚼性随着压力的增大先增加后略有下降,但均高于对照组。

目前国内外已有的关于超高压辅助小龙虾脱壳对其品质的影响的研究报道主要集中于超高压处理对小龙虾脱壳效率及虾仁外在品质的影响,对于肌肉内在品质(肌原纤维蛋白理化性质:肌原纤维蛋白含量、表面疏水性、Ca2+-ATPase活性、总巯基含量以及羰基含量)的影响的研究报道较少。

本研究以鲜活小龙虾为原料,探究小龙虾的超高压处理脱壳的脱壳时间、虾肉完整率、汁液流失率以及脱壳后小龙虾肌原纤维蛋白含量、表面疏水性、Ca2+-ATPase活性、总巯基含量以及羰基含量的影响,为预处理辅助脱壳在小龙虾机械剥壳的产业应用中提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

鲜活小龙虾,单只质量为(18.5±2.2)g,在2022年6—9月期间,购于上海市江杨水产批发市场,室温下无水保活运输到实验室,待用。

考马斯亮蓝染色试剂盒(常规法),上海碧云天生物技术有限公司;无水氯化钾、钼酸铵、无水硫酸钠、氯化钾、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、乙二胺四乙酸(EDTA)等分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HPP.L1-500/10 超高压设备,天津市华泰森淼生物工程技术有限公司;SpectraMaxi3多功能酶标仪,美国美谷分子仪器公司;VS-15000CFNⅡ高速冷冻离心机,上海民仪电子有限公司;GTR16-2高速台式冷冻离心机,北京时代北利离心机有限公司;BPG-9056A精密鼓风干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;DK-S22电热恒温水浴锅,上海精宏实验设备有限公司;XS-105梅特勒电子天平,梅特勒-托利多国际贸易有限公司;NR60CP色差仪,深圳三恩时科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 超高压处理

将质量相近的鲜活小龙虾清洗干净,确保清洗后的小龙虾仍然鲜活。将鲜活小龙虾放入真空袋(每袋10只虾),密封,置于超高压处理釜中。高压腔内介质水的温度为25℃。在预试验基础上,选择的脱壳试验参数见表1,高压处理后进行手工脱壳。

表1 超高压脱壳试验参数Tab.1 Different ultra-high pressure shucking treatments

1.3.2 脱壳时间和虾仁完整性的检测

脱壳时间的检测参照汪兰等[7]的方法,略做修改。未作处理的生鲜虾以及超高压处理的小龙虾进行手工脱壳。手工脱壳的步骤包括:掰掉头部、去前两节壳、将虾仁从虾壳抽出。若抽不出,则一节节将外壳除去。每组10只小龙虾,从去第一节壳开始记录脱壳时间。

虾仁完整率:当脱壳预处理后的小龙虾同时满足脱壳后虾仁肌肉完整和尾部不断裂两条件时将虾仁判断为完整的[9],虾仁完整率参照公式(1)计算:

X=100%×n/N

(1)

式中:X为虾仁完整率;n为完整虾仁个数,个;N为总虾个数,个。

1.3.3 汁液流失率测定

用滤纸吸干鲜活小龙虾、脱壳后虾仁以及虾壳与虾头等废料的表面水分,在准确称取之后将其分别记为M0、M1和M2,每个处理组进行3次平行试验[10]。参照公式(2)计算:

CM=100%×(M0-M1-M2)/M0

(2)

式中:CM为小龙虾的汁液流失率;M0为鲜活小龙虾的质量,g;M1为脱壳后虾仁的质量,g;M2为虾壳及虾头等废料的质量,g。

1.3.4 肌原纤维蛋白的提取和制备

从小龙虾虾仁的第一腹节处称取1.0 g,然后按照孟粉等[11]的方法,首先加入10倍体积4℃的蒸馏水,均质2 min后以10 000 r/min离心5 min(离心半径为6 cm,下同),留下沉淀,加入10倍体积4℃的KCl(50 mmol/L)均质1 min后以10 000 r/min离心5 min,再留下沉淀加入10倍体积4℃的0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-马来酸缓冲溶液(pH 7.0),匀浆30 s后放置1 h(4℃)后取出,10 000 r/min离心15 min后取上清液。肌原纤维蛋白含量的测定根据Bradford蛋白浓度测定试剂盒使用说明进行。

1.3.5 肌原纤维蛋白的表面疏水性测定

肌原纤维蛋白的表面疏水性的测定参考ChelhI等[12]和Lü等[13]的方法测定。样品组分别加入500 μL的肌原纤维蛋白溶液(1 mg/mL)、100 μL溴酚蓝溶液(BPB,1 mg/mL),空白组分别加入500 μL的0.6 mol/L KC1-20 mmo1/L Tris-马来酸(pH 7.0)、100 μL BPB溶液(1mg/mL)。混匀后,室温下经漩涡振荡器震荡反应15 min,接着经10 000 r/min离心15 min(离心半径为6 cm),取150 μL上清液加入1 350 μL蒸馏水进行稀释,稀释后使用酶标仪测量其吸光度(在595 nm处)。表面疏水性即肌原纤维蛋白结合的BPB(μg/mg)的量。参照公式(3)计算:

HY=200×(A1-A2)/A1

(3)

式中:HY为表面疏水性值,μg/mg;A1为空白组吸光度;A2为样品吸光度。

1.3.6 肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性测定

参照李姣等[14]和蓝蔚冰等[15]的方法进行Ca2+-ATPase活性测定,略做修改。反应管中依次加入250 μL肌原纤维蛋白溶液(3 mg/mL)、75 μL Tri-马来酸溶液(0.5 mol/L、pH=7.0)、75 μL CaCl2溶液(0.1 mol/L)、795 μL蒸馏水和75 μL ATP溶液(20 mmol/L,pH=7.0),混匀,静置反应10 min(室温条件下)后加入250 μL三氯乙酸(15%)后经6 000 r/min离心5 min(离心半径为6 cm)。留下上清液,使用钼酸铵法进行中无机磷含量测定:管中加入500 μL上清液,1 250 μL蒸馏水,使用旋涡振荡器混匀后依次加入500 μL硫酸钼酸,250 μL米吐尔试剂,再次混匀,发色45 min(25℃条件下),640 nm下测定其吸光度。试验过程中的空白管先加三氯乙酸,再加ATP溶液。Ca2+-ATPase活性以每小时每毫克肌原纤维蛋白中ATP酶分解ATP产生1 μmol无机磷的量来计算。参照公式(4)计算:

AC=(A-B)×60/(t·M)

(4)

式中:AC为Ca2+-ATPase活性,μmol/mg;A为1 mL反应液生成的磷酸量,μmol;B为空白值,μmol;t为反应时间,min;M为1 mL 反应液所含的肌原纤维蛋白量,mg;60为1 h=60 min。

1.3.7 肌原纤维蛋白总巯基含量的测定

参照石钢鹏等[16]的方法进行总巯基含量测定,稍做修改。其具体操作如下:

(1)Tris-HCl缓冲液:同一个烧杯中加入2.423 g Tris、48.048 g尿素、0.292 2 g EDTA和2 g SDS,加入水将其溶解,用6 mol/L盐酸将溶液的pH至7.0,定容至100 mL。

(2)0.1%DTNB:同一个烧杯中加入2.423 g Tris和0.1 g DTNB,加入水将其溶解,用6 mol/L 盐酸将溶液的pH至8.0,定容至100 mL。

(3)样品管:依次加入1 mL肌原纤维蛋白溶液(4 mg/mL),9 mL、0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液,振荡混匀,放置30 min(室温条件下),取4 mL,加入0.4 mL 0.1%DTNB,在40℃反应25 min后,于412 nm处测定其吸光值。

(4)对照管:依次加入1 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-马来酸溶液(pH 7.0),9 mL、0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液,振荡混匀,放置30 min(室温条件下),取4 mL,加入0.4 mL、0.1%DTNB,在40℃反应25 min后,于412 nm处测定其吸光值。

X1=(A×D)/(ε×C0)

(5)

式中:X1为总巯基含量(mol/g);C0为肌原纤维蛋白质量浓度,mg/mL;A为412 nm处的吸光值;D为稀释倍数;ε为摩尔消光系数,其值为13 600 L/(mol·cm)。

1.3.8 肌原纤维蛋白羰基含量的测定

羰基含量的测定参照石钢鹏等[16]的方法并稍做调整,样品管及空白对照管均加入0.5 mL的肌原纤维蛋白,然后两种管中分别加入2 mL DNPH(浓度为10 mmol/L,以2 mol/L HCl作为溶剂)溶液和2 mL、2 mol/L HCl溶液,充分混匀,避光常温下反应1 h(期间每15 min振荡一次)后加2.5 mL、20%三氯乙酸溶液,4℃、12 000 r/min离心10 min(离心半径为6 cm,下同),缓慢倒去上清液后在沉淀中加入2 mL乙醇:乙酸乙酯混合液(1∶1)清洗,该操作重复3次后留沉淀,加入6 mL溶解剂(6 mol/L盐酸胍,以2 mol/L HCl作为溶剂),37℃条件下放置 10 min后经12 000 r/min离心10 min(4℃),移取上清液,在 370 nm 波长下测定其吸光度。羰基含量(X2)参照公式(6)计算:

X2=(A×D)/(ε×C0)

(6)

式中:X2为总羰基含量,mol/g;C0为肌原纤维蛋白质质量浓度,mg/mL;A为379 nm 处的吸光值;D为稀释倍数;ε为摩尔消光系数,其值为22 000 L/(mol·cm)。

1.4 数据分析

每一组试验重复次数不少于3次,通过使用Origin 2021和SPSS 19分别获取数据分析结果“平均值±标准差”和差异性分析结果。使用Origin 2021作图。

2 结果与讨论

2.1 超高压脱壳预处理对小龙虾脱壳效果的影响

脱壳时间是决定小龙虾脱壳生产效率和成本的最直接的小龙虾脱壳效果指标[17]。而虾仁的完整率的高低能推测小龙虾虾尾断裂程度以及虾仁肌肉破裂程度。

表2可知,小龙虾的脱壳时间:生鲜组>150 MPa、3 min超高压处理组>其他超高压处理组,超高压处理可以缩短小龙虾的脱壳时间,提高其脱壳效率。150 MPa、3 min处理后的小龙虾的脱壳时间较长,这是因为虾壳与虾仁组织之间仍有粘连,这表明虾壳和肌肉间的表皮连接蛋白的变性程度较低[7,18]。试验过程也发现,150 MPa、3 min后的小龙虾会有部分肉粘连在虾壳上面,会有虾肉不完整、断尾现象。除150 MPa、3 min处理组外,其他各超高压处理组的虾肉的完整性显著提高且达到100%(P<0.05)。主要原因可能是小龙虾的表皮的主要成分是蛋白,小龙虾的外壳和肌肉的结合特点为通过表皮连接,超高压使得壳肉之间的表皮连接蛋白发生破坏、变性,从而导致壳肉出现分离现象[7,18-20]。

表2 超高压脱壳预处理对小龙虾虾脱壳时间、虾仁完整率及汁液流失率的影响Tab.2 Effects of ultra-high pressure pretreatments before shucking on shucking time and the integrality and drip lose of crayfish meat

一定压力范围内,压力和壳肉之间的表皮连接蛋白变性程度呈现正相关的关系,压力越大,壳肉分离难度越低,脱壳后虾仁完整性越高,压力增大到脱壳的界限值后,虾仁完整率达到最大值[10]。小龙虾的汁液流失率随压力的增大呈现先降后升的趋势,这一结果表明适当的压力可以降低小龙虾的汁液流失率。在200 MPa以及250 MPa处理下,小龙虾的汁液流失率随着时间的延长出现先降后升的趋势,这可能是因为在前5 min时超高压通过氢键和疏水性相互作用促进交联,可以保留水分子[21-22],使得汁液流失率降低,但随着保压时间的延长,先前结合的一部分析出的水分有少部分重新被挤出[23]。汁液流失率的升高可能是过度的压力处理显示出破坏性的效果,直接从纤维中挤出水分[24]。

2.2 超高压脱壳预处理对小龙虾肌原纤维蛋白理化性质的影响

2.2.1 超高压脱壳预处理对虾仁肌原纤维蛋白含量的影响

肌原纤维蛋白和其盐溶性关系表现为肌原纤维蛋白发生变性会导致盐溶性降低,蛋白聚集程度升高从而致使能提取到的肌原纤维蛋白含量下降[25],故肌原纤维蛋白含量可作为蛋白变性的指标之一。

小龙虾虾肉肌原纤维蛋白含量的变化如图1所示。

注:不同字母表示差异显著(P<0.05),下同图1 超高压脱壳预处理对虾仁肌原纤维蛋白含量的影响Fig.1 Effects of ultra-high pressure pretreatments before shucking on myofibrillar protein content in fresh crayfish

相同保压时间下,肌原纤维蛋白含量随压力的增大呈现下降的趋势。与生鲜组对比,150 MPa、3 min处理组对虾仁肌原纤维蛋白含量无显著影响。150 MPa(3、5、7 min)处理后的小龙虾肌原纤维蛋白含量比其他处理组的含量高。与其他超高压处理组相比,250 MPa(5、7 min)以及300 MPa(1、3、5 min)处理组的肌原纤维蛋白含量更低,较生鲜组减少了47.82%～84.71%。200 MPa(1、3、5 min)处理组之间的肌原纤维蛋白含量没有显著性差异(P>0.05),较生鲜组减少了17.25%～18.89%。结果表明不同肌原纤维蛋白溶解性在经不同超高压剥壳预处理后出现不同程度的变化。肌原纤维蛋白含量减少的诱因可总结为高压作用下肌原纤维蛋白遭受的这三点影响:1)肌原纤维蛋白的三级结构被破坏使得蛋白质变性,从而影响其溶解性;2)肌原纤维蛋白的相互作用增强,促进凝胶形成;3)酶被激活,使得蛋白被酶降解[26]。

2.2.2 超高压脱壳预处理对虾仁肌原纤维蛋白表面疏水性的影响

未变性蛋白因其疏水基团被包裹在蛋白质分子内部而表现出较低的表面疏水性,表面疏水性越高说明蛋白质疏水基团暴露的数量越多,蛋白质变性程度越高[16,27]。根据图2可知,相同保压时间下,小龙虾的表面疏水性值呈现出随着压力的增大而上升的趋势。

图2 超高压脱壳预处理对虾仁肌原纤维蛋白表面疏水性的影响Fig.2 Effects of ultra-high pressure pretreatments before shucking on surface hydrophobicity of myofibrillar protein in fresh crayfish

与生鲜组对比,150 MPa、3 min处理后的虾仁肌原纤维蛋白的表面疏水性值和肌原纤维蛋白含量分别表现出显著上升(P<0.05)和不存在显著差异(P>0.05)两种变化。王芝妍等[28]也得出类似结论,与生鲜组对比,100 MPa(5 min)处理对表面疏水性存在显著性影响(P<0.05)的同时对肌原纤维蛋白含量无显著性影响(P>0.05),其原因尚未得知。300 MPa、5 min处理后小龙虾肌原纤维蛋白表面疏水性达到了63.59±0.90 μg/mg。与生鲜组对比,经过超高压处理后,表面疏水性值上升了11.61%(150 MPa、3 min)～101.55%(300 MPa、5 min),这说明蛋白质分子内部的疏水基团外露。一个可能的原因是肌原纤维蛋白三级结构在压力作用下受到破坏后致使疏水基团暴露于蛋白质表面[29]。Chapleau等[30]认为高压作用下蛋白质结构的重新修饰会促使新的疏水位点的出现。Ko等[31]认为对压力敏感的氨基酸残基的暴露是疏水相互作用增强的原因。

2.2.3 超高压脱壳预处理对虾仁对肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性的影响

小龙虾肌原纤维蛋白含有肌球蛋白,肌球蛋白因其头部稳定性差而易发生变性引起Ca2+-ATPase活性下降[16,32]。Ca2+-ATP酶活性高表明蛋白质变性程度低,因此Ca2+-ATP酶活性可作为蛋白质变性指标。

小龙虾的Ca2+-ATPase活性在不同超高压剥壳预处理条件下的变化如图所示,与文献报道类似[33-34]。对比Ca2+-ATPase活性和肌原纤维蛋白含量(图3)数据可以发现,与生鲜组对比,Ca2+-ATPase活性经150 MPa、3 min处理后显著降低(P<0.05),但肌原纤维蛋白含量无显著性变化(P>0.05),说明Ca2+-ATPase活性和肌原纤维蛋白含量并不存在绝对的对应关系。

图3 超高压剥壳预处理对虾仁肌原纤维蛋白Ca2+-ATP酶活性的影响Fig.3 Effects of ultra-high pressure pretreatments before shucking on Ca2+-ATPase activity of myofibrillar protein in fresh crayfish

生鲜小龙虾虾肉的Ca2+-ATP酶活性大约为1.77±0.03 μmol/(mg·h)与其相比,所有超高压处理组的Ca2+-ATPase活性均显著下降(P<0.05)。其中,较生鲜组,250 MPa(3、5、7 min)和300 MPa(3、5 min)处理组的Ca2+-ATPase活性损失超过70%。200 MPa(1、3 min)处理后其Ca2+-ATPase活性较生鲜组分别减少8.66%和27.31%。结果表明,无论压力如何,超高压都会导致小龙虾肌球蛋白或肌动球蛋白头部结构发生改变而使酶活性发生变化。Xuan等[26]也得到类似的结论,Ca2+-ATPase活性的下降可能是由于肌球蛋白原有的蛋白质相互作用在压力作用下被破坏后发生重排生成不溶性大分子聚集体,使得Ca2+-ATPase活性丢失。

2.2.4 超高压脱壳预处理对虾仁肌原纤维蛋白巯基含量的影响

巯基是蛋白质中最活跃的功能团之一。蛋白质构象的变化可以通过巯基和二硫化物连接之间的转变来反映[35]。不同超高压剥壳预处理和小龙虾肌原纤维蛋白巯基含量的关系如图4所示。

图4 超高压脱壳预处理对虾仁肌原纤维蛋白巯基含量的影响Fig.4 Effects of ultra-high pressure pretreatments before shucking on total sulfhydryl content of myofibrillar protein in fresh crayfish

由图4可知,超高压导致总巯基含量下降。150 MPa(5、7 min)和200 MPa、1 min处理组间的肌原纤维蛋白巯基含量差异不大(P>0.05)。250 MPa(1、3、5、7 min)与300 MPa(1、3、5 min)处理后肌原纤维蛋白巯基含量下降到生鲜组的62.32%～67.75%。对比各处理组巯基与羰基含量变化趋势,200 MPa(3、5、7 min)和250 MPa(1、3、5、7 min)各处理组之间的巯基含量没有显著性差异(P>0.05),但羰基含量与之相反,羰基含量显著上升,推测这可能是在压力处理下羰基形成比巯基生成二硫键的速度更为迅速、敏感,具体原因尚待进一步研究。巯基含量的下降表明小龙虾经超高压处理过程中肌原纤维蛋白逐渐发生氧化等变化[28]。巯基含量的下降可能是超高压处理促进了埋在蛋白质核心中的疏水基团和巯基的暴露,暴露的巯基形成二硫键诱导蛋白构象发生改变[36],另外,在压力作用下,原先的巯基间距离缩短也会促使二硫键的生成[10]。

2.2.5 超高压脱壳预处理对虾仁肌原纤维羰基含量的影响

羰基含量是判断蛋白质氧化的指标之一[24],羰基含量的增加会使得肌原纤维蛋白构象发生变化而导致聚集,从而影响肉类的营养价值[37-39]。在氧自由基的存在下,蛋白质分子会被其修饰然后形成羰基,因此蛋白质氧化损伤程度的判断可根据羰基含量高低进行[40-42]。超高压剥壳预处理对虾仁肌原纤维蛋白羰基含量的影响由图5所示。

图5 超高压剥壳预处理对虾仁肌原纤维蛋白羰基含量的影响Fig.5 Effects of ultra-high pressure pretreatments before shucking on carbonyl content of myofibrillar protein in fresh crayfish

由图5可知,小龙虾肌纤维蛋白羰基含量随着超高压压力的增大而不断上升(P<0.05)。相同压力,不同保压时间下的小龙虾肌原纤维蛋白羰基含量没有显著性(P>0.05),相同保压时间,不同压力下的小龙虾肌原纤维蛋白羰基含量存在显著性差异(P<0.05),这说明相比于保压时间,压力对羰基含量的影响更大的同时也表明肌原纤维蛋白在超高压作用下发生了明显的蛋白氧化。可以看出,相对其他处理组,300 MPa(1、3、5 min)处理条件下羰基含量的上升更明显。羰基含量上升可能是由于压力处理过程中生成自由基,释放的自由基氧化被压力破坏的肌原纤维蛋白,压力上升时自由基释放量持续增加,蛋白质被自由基氧化生成羰基的速率加快,羰基含量明显上升[43-45]。

3 结论

超高压处理后的小龙虾脱壳时间缩短,汁液流失率均低于生鲜组。随着压力的增大,各处理组的虾肉完整率均达到100%(150 MPa,3 min处理组除外)。超高压处理会破坏蛋白质的三级结构,导致肌原纤维蛋白变性。与生鲜组对比,超高压处理后的小龙虾肌原纤维蛋白表面疏水性值及羰基含量增大,虾肉肌原纤维蛋白含量(150 MPa、3 min处理组除外)、肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性和巯基含量均显著下降。综合Ca2+-ATPase和巯基含量这两个指标来看250 MPa(3、5、7 min)与300 MPa(1、3、5 min)处理组下的肌原纤维蛋白发生明显变性。综合以上对脱壳效果及肌原纤维蛋白理化指标的分析,认为超高压组中的200 MPa、1 min是相对最佳的小龙虾脱壳工艺参数。