生物絮团系统在氮转化过程中的微生物多样性变化

秦海鹏，王 博，廖栩峥，胡世康，赵吉臣，何子豪，杨世平，孙成波

(广东海洋大学水产学院，广东 湛江，524088)

生物絮团技术(BFT)具有降低饲料系数、提高养殖动物存活率并能减少养殖污水排放等特点，可以有效解决当前水产养殖业发展所面临的饲料成本和环境污染等问题[1]。BFT能在零或低水交换率的条件下改善养殖水体有毒有害无机氮的积累[2]。氨氮胁迫对生物絮团模式的养殖功效的影响，证实了生物絮团具有清洁水质、促进虾生长和生理健康的作用[3]。不同蛋白水平对生物絮团模式的养殖有不同的功效，生物絮团可以显著提高养殖系统中对虾的生理健康水平，减少病害的爆发，阻绝病害的传播等[4-5]。养殖水体菌群组成直接影响对虾的生长发育和健康状态[6-7]，在物质循环、拮抗病原、调节水质与维持育苗系统稳定等方面发挥积极作用[8-9]。生物絮团模式的养殖水体中微生物群落与活性污泥的微生物群落会受到营养物质、温度、盐度、化学需氧量和溶氧的影响[10]。目前，国内应用BFT进行水产养殖的研究开始由试验阶段过渡到中试规模的养殖试验[11-12]。尽管生物絮团被广泛应用在零换水工厂化循环水养殖模式中，但其仍存在不少问题，其作用机理尚不明确，与生物絮团系统的微生物结构与多样性的动态变化相关的研究不足。高通量测序技术可以灵敏地探测环境微生物多样性，实现宏基因组水平上多重样品间的平行比较研究[13]，全面地指示对虾健康状态与菌群特征关系[14-16]。通过高通量测序分析生物絮团系统在氮转化过程中微生物多样性的变化，旨在为生物絮团系统在工厂化循环水养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验在设有防逃网的0.3 m3的蓝色塑料桶中进行，水体体积250 L，生物絮团从盐度25的养殖池中用200目的筛绢网捞取。经过1周时间暂养的日本对虾，体长(9.20±0.04) cm，体质量(9.53±0.71)g。

1.2 试验设计

试验在广东海洋大学水产学院东海岛海洋生物研究基地进行。将日本对虾随机分为2个试验组，每组3个重复，饲养密度250 尾/m3；对照组水体为清洁的消毒海水，日换水量20%。试验组在消毒海水中加入初始量为20 mL/L的生物絮团，试验周期为30 d，24 h连续充气。

1.3 水样收集

在30 d试验期间，每天测定氨氮，亚硝酸盐氮和硝酸盐氮，水质生化分析收集的水样(100 mL)在真空压力下通过0.45 μm GF/ C滤纸过滤。

1.4 水体菌群取样和DNA提取

根据水质测定结果取试验组第1天、第10天和第30 天水样(分别标记为Cb、Zb和Qb)，水样使用无菌瓶收集，通过0.2 μm孔径的聚碳酸酯过滤器(Millipore Corporation，USA)过滤100 mL的混合物以获得微生物样品。使用Omega EZNA Water DNA试剂盒(Omega Bio-Tek，USA)从微生物样品中提取总基因组DNA。通过使用特异性引物扩增16S rRNA基因的V4区：515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R(5'-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3')。将PCR产物(320～350 bp)再循环以构建扩增子文库，然后在Miseq平台(Illumina，USA)上进行测序。

1.5 序列数据分析

根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样品数据，对样品的reads进行拼接，经过过滤操作，得到高质量的Tags数据(Clean Tags)。基于Clean Tags进行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类(OTU分析)[17]。根据OTUs聚类结果，一方面对每个OTU的代表序列做物种注释，得到对应的物种注释信息和基于物种的丰度分布情况。同时，对OTUs进行丰度(统计，可视化)、Alpha多样性分析等，以得到样品内物种丰富度和均匀度信息、不同样品或分组间的共有和特有OTUs信息等[18-19]。

1.6 水质测定方法与数据分析

氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮质量浓度根据《养殖水环境化学实验》测定[15]。所有数据采用Graphpad Prism8.0软件统计分析，用SPSS 19.0进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 生物絮团系统养殖过程中的氮转化

氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮在系统中的转化过程如图1所示。

图1 生物絮团系统中氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的变化

在试验过程中，对照组的水体微生物无法有效转化多余的残饲粪便，无机氮逐渐累积[20-21]。随着试验的进行，水体中的氨氮呈先升高后降低的趋势。对照组氨氮始终高于试验组，试验组氨氮在第5天达到最大质量浓度(2.99 mg/L)，之后在第9天降低至趋于0 mg/L；对照组在第9天达到最大质量浓度(7.51 mg/L)，之后在第26天降低至趋于0 mg/L。表明生物絮团能促进水体中的氮转化进程[22]。亚硝酸盐氮在试验组中产生和去除的时间少于对照组，试验组在第17天达到最大质量浓度(12.54 mg/L)，之后在第28天降低至趋于0 mg/L；对照组的亚硝酸盐氮质量浓度在试验周期30 d内呈不断升高的趋势，在第30天达到13.42 mg/L。氨氮与亚硝酸盐氮在水体中呈先升高后降低的趋势，这与其他相关研究结果[4]相同。氨氮的累积快于亚硝酸盐氮的累积，更快于硝酸盐氮[23]，分析水体中氨化细菌的繁殖要快于亚硝化细菌与硝化细菌[24]。试验组的硝酸盐氮质量浓度高于对照组，在第30天两组分别达到19.56和6.31 mg/L。据报道，在盐度为35的水体中，斑节对虾对硝酸盐氮的耐受性高达232 mg/L[25-26]。试验结果显示，从第13天到第22天出现的降温也影响到了氮转化进程，水体中氨氮与亚硝酸盐氮的质量浓度均出现停滞，相关研究[27]也证明了温度对生物絮团的影响。

2.2 水体菌群丰度和多样性

如图2所示，利用 16S rRNA 基因 V3+V4 区域 illumina 测序从水体微生物群落中获得了3 500个OUT(操作分类单元)，Cb、Zb和Qb分别为1 932、2 209和2 023个OUT，3个试验组之间具有907(25.9%)个共同的OUT。采用 ace、chao1和observed otus计算了基于OUT的菌群丰度指数，并采用shannon和simpson评估菌群多样性指数，ace、chao1、observed otus和simpson的丰度随养殖周期的增加均显著增加，shannon多样性在Zb期最高，Cb期最小，不同时期差异显著(表1)。

图2 不同时期的水体菌群韦恩图

表1 不同时期的水体菌群多样性指数

注：同列中标有不同字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性(P>0.05)

2.3 不同时期的水体菌群组成差异

共鉴定出23个门549个属。如图3A所示，在门水平上，变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)是主要的细菌，在试验周期中变形菌门(Proteobacteria)相对丰度随时间增加而降低，拟杆菌门、绿弯菌门、放线菌门相对丰度随时间增加而增加。如图3B所示，在属水平上，Ardenscatena、冷蛇菌属(Psychroserpens)、Inquilinus和Marinicella是最主要的细菌，三价铁和硝酸盐还原细菌、冷蛇菌属和Marinicella相对丰度随时间增加而增加。如图3C所示，与氮转化有关的主要的菌有Ardenscatena、硝化螺旋菌(Nitrospiraceae)、亚硝化单胞菌(Nitrosomonadaceae)、Ardenscatena、Nitrospiraceae和Nitrosomonadaceae相对丰度随时间增加而增加，氨氧化古菌相对丰度随时间增加而降低。其中，Ardenscatena属内菌种，能够将硝酸盐氮还原至亚硝酸盐氮，参与水体氮循环过程。氨氧化古菌属的分类归于古生菌，可以将氨氧化成亚硝酸盐氮[28]。在上述菌属协同作用下，生物絮团能有效调控水体中的氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮[29]。与氮转化有关的菌的丰度随水体中氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的质量浓度变化而变化。生物絮团系统在培育过程的不同时期既存在着共有种属，同时也存在着各自独特的微生物种属，微生物种属之间的协同和竞争作用，形成了特定的生态位群落结构[30]。

图3 不同时期在门水平(A)、属水平(B)以及与氮转化(C)相关的水体菌群相对丰度

在门水平上变形菌门和拟杆菌门是主要的细菌，在所有类型的生物絮团中占很大比例。这与杨章武等的研究结果相类似[31]。在试验周期中变形菌门相对丰度随时间增加而降低，拟杆菌门、绿弯菌门和放线菌门相对丰度随时间增加而增加。水体中大多数变形菌门是养殖系统中的共生细菌[32]。在生物絮凝物的废水处理中，变形菌门用于去除有机物质[33-34]。变形菌门在生物絮团细菌组成中起着重要作用[35-36]。因此，在凡纳滨对虾的生物絮团养殖模式下，变形菌门的存在可以有效调节水产养殖水体的水质。放线菌门是一种常见的益生菌，可以在特定环境中产生有益物质[37]。

2.4 不同时期水体菌群种类和丰度差异及距离矩阵PCoA

在图4中根据加权和未加权UniFrac距离矩阵PCoA图分析，可知同组样本之间物种可以很好地聚在一起，不同组之间可以清楚地分离出来。

图4 不同时期水体菌群的加权UniFrac距离矩阵PCoA图

通过LDA值分布柱状图分析，得到不同组间微生物分类相对丰富的差异。如图5所示，LEfSe的LDA值计算结果显示，具有显著差异的细菌群落在Cb组中最多且相对丰度最大，Zb组最少且相对丰度最小，菌群丰度随着时间的增加，先减少后增加[28-29]。可以得出，经过培养的稳定的生物絮团系统中，水体菌群的多样性有所减少、丰度有所增加，这与夏耘等[30]的研究结果相似。根据结果分析， 原因应该是稳定的系统中水体优势菌群

图5 不同时期水体菌群的LDA值分布柱状图

的丰度进一步增加，在全部菌群中占据更大的比例。根据LDA值分布柱状图的结果可以得出，经过培养的稳定的生物絮团系统中，水体菌群的多样性更为丰富，稳定后的生物絮团系统与刚接种时的生物絮团系统相比，水体菌群的结构发生了显著变化。

3 结论

生物絮团系统在培育过程中，通过微生物群落间的演替作用，实现群落类型的稳定及自身功能的稳定与可持续。生物絮团系统的微生物群落结构与多样性在水体氮循环过程中存在变化情况，通过高通量测序分析生物絮团系统在氮转化过程中水体菌群的多样性变化，结果显示，经过培养的稳定的生物絮团系统中，水体菌群的多样性有所减少、丰度有所增加，菌群涉及氮转化相关的关键属在不同时期具有显著变化。因此，在生物絮团系统养殖模式的应用中，稳定的生物絮团培养需要一定的时间，从而为水体中与氮转化相关的水体微生物的演替提供时间和物质环境的准备，提高对生物絮团系统的有效利用。

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