影响食用菌总汞含量测定准确度的关键技术探索*

王 娟，华 蓉，游金坤，邓雅元，孙达锋，杨璐敏，吴素蕊**

（1.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省食用菌产业发展研究院，云南 昆明 650221）

农产品质量安全与人们的健康息息相关。随着工业经济的飞速发展，农产品中重金属含量及其危害引起了人们广泛关注。2022年6月30日发布的《食品安全国家标准食品中污染物限量》（GB 762-2022）[1]中对污染物铅、镉、汞、砷、锡、镍、铬的限量做了进一步的细化和调整，其中对食品类别进行了重新划分，尤其是对食用菌。因食用菌的生物学特性及加工保存特点，对其相关污染物限量的针对性更强，这对污染物检测工作也提出了更高要求。

元素的化学形态与其毒性、生物可利用性、迁移性密切相关。汞在自然界中以3种形态存在，即单质汞、无机汞和有机汞，在生物圈中易于迁移和转化，最终可通过呼吸道、食物链等路径传递给人类，威胁人类健康[2-6]。食用菌作为广受人们喜爱的大型真菌，其重金属安全问题一直备受关注[7-12]，因此其重金属含量检测数据的准确性对产品质量的判定非常重要。

原子荧光法作为汞试样测定的主要方法一直被广泛应用[13-15]。同时，采用微波消解处理样品具有消解速度快、消解效率高、分析准确度高、环保节能、平行性良好、重复性高等优点[16-17]，是实验室优选的样品处理方法。

不确定度是表征测量结果量值分散程度的参数，是对测定结果可靠程度的评定，是一个完整的定量分析结果不可或缺的组成部分[18-21]。通过评定不确定度，不仅可以对测量结果进行有效的质量控制，分析影响结果准确性的关键试验技术控制点，同时还可提高结果的可靠性和分析测试人员的技术水平，了解结果判定的风险，也便于实验室间检测结果的比对[22-23]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

重铬酸钾、硝酸、氢氟酸、氢氧化钾，优级纯，重庆川东化工（集团）有限公司；硼氢化钾（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；GSB 04-1729-2004汞标准溶液 （1 000±1） μg·mL-1，国家有色金属及电子材料分析测试中心；香菇粉分析标准物质（指定值为 0.193 mg·kg-1，│Z│≤2时标准值为0.162 mg·kg-1～0.224 mg·kg-1， 标 准 物 质 编 号P36471），广州谱恩科学仪器有限公司。

1.2 仪器与设备

Kylin 12型原子荧光光度计，北京吉天仪器有限公司；T-214电子天平，北京赛多利斯仪器有限公司；MARS 6微波消解仪，美国CEM公司；UPR-Ⅱ-10T超纯水仪，四川优普超纯科技有限公司；单标线吸量管A级（1 mL），四川蜀玻（集团） 有限责任公司；单标线容量瓶A级（10 mL、25 mL、50 mL、100 mL），天津市天科玻璃仪器制造有限公司。

器具均按照国家的检定规程要求进行检定，计量性能见表1。

表1 器具计量性能Tab.1 Measuring performance of instruments

1.3 试验设计

1.3.1 依据标准

1）检测试验：参照《食品安全国家标准食品中总汞及有机汞的测定》（GB 5009.17-2021）[24]中的第一法——原子荧光光谱分析法，试样采用微波消解。

2）不确定度计算：依据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1-2012）[25]及《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS-GL006：2019）[26]，以评价试验关键技术准确度。

1.3.2 试样处理

称取试样0.2 g～0.3 g于微波消解内管中，用少量纯水润湿，在通风橱中加入硝酸8.0 mL，过夜。次日加入氢氟酸0.5 mL，混匀使样品与消解液充分接触。将内管置于消解罐中密封，放入微波消解仪内进行微波消解。微波消解升温程序见表2。

表2 微波消解升温程序Tab.2 Temperature rise procedure of microwave digestion

如表2所示程序进行微波消解，程序结束后冷却至室温。将消解内管取出，缓慢泄压放气后打开盖子，将内管移入赶酸器。设置温度150℃，加热至管内液体为1 mL左右，取出，冷却至室温。用纯水多次洗涤内管以便将液体全部转入25 mL容量瓶中，用纯水定容，混匀。同时按照以上相同的试剂和步骤进行空白试验。放置0.5 h，上机测定。

1.3.3 校准系列溶液的制备

使用汞标准固定液（5%硝酸+0.05%重铬酸钾的混合溶液）作为定容介质，将汞标准贮备液（1 000 μg·mL-1）稀释配制成100 ng·mL-1的汞标准使用液。用1 mL单标线吸量管移取1 mL汞标准使用液于50 mL容量瓶中，使用体积分数为10%的硝酸溶液定容，混匀，配制成2 ng·mL-1的汞标准工作液。再使用原子荧光光度计自动配制标准系列溶液，质量浓度分别为 0、0.20 ng·mL-1、0.50 ng·mL-1、1.00 ng·mL-1、1.50 ng·mL-1、2.00 ng·mL-1。自动配制标准曲线可最大限度避免由于试剂纯度不高、玻璃器皿污染等随机影响引起的测量结果准确度下降。

1.3.4 仪器工作参数

依据原子荧光光度计仪器使用说明书调节仪器至最佳工作状态。汞测量条件：光电倍增管负高压为270 V；灯电流为60 mA；原子化器温度为200℃；载气流量为400 mL·min-1；屏蔽器的流量为800 mL·min-1；读数时间为16 s；延迟时间为1 s；测量方式为校正曲线法；读数方式为读取峰面积；载流为3%硝酸溶液；还原剂为0.5%硼氢化钾+0.5%氢氧化钾的混合溶液。

1.3.5 含汞量结果计算

根据《食品安全国家标准食品中总汞及有机汞的测定》（GB 5009.17-2021）[24]中的原子荧光光谱分析法可知，总汞含量（X，mg·kg-1）计算公式为：

式中：ρ为试验溶液中总汞含量（μg·L-1）；ρ0为空白液中总汞含量（μg·L-1）；V为试样消解液定容总体积（mL）；m为试样称样量（g）。

1.3.6 不确定度计算及分析

1）标准不确定度：选择影响测定结果准确性的关键技术进行针对性分析，计算各技术点的标准不确定度。

2）合成标准不确定度：以各个关键技术的标准不确定度为基础，计算并综合分析合成标准不确定度。

3） 扩展不确定度：以合成标准不确定度为基础，计算得到扩展不确定度。

4）准确度评价：最终以扩展不确定度评定试验关键技术的影响，确定食用菌总汞含量测定的准确度。

2 结果与分析

2.1 关键试验技术分析

根据汞含量测定的试验步骤及结果计算方法，重点对试样称量、试液定容体积、标准液中汞的含量、测量重复性和回收率试验5个影响结果准确度的试验关键技术点进行分析评定。这5个关键技术点的相对标准不确定度分别为：1）试样质量称量的相对标准不确定度[urel（m）]；2）试样消解液的定容体积相对标准不确定度[urel（V）]；3）试验溶液中汞的质量浓度相对标准不确定度[urel（ρ）]；4）测量重复性的相对标准不确定度[urel（x）]；5）回收率随机差异的相对标准不确定度[urel（R）]。对这5个标准不确定度进行综合分析，确定影响测量结果的合成标准不确定度（u），即可计算整个检测试验的扩展不确定度（U），从而对试验及测量结果进行准确度评价。

2.2 5个关键试验技术点的影响评价

2.2.1 试样质量称量影响评价

以试样质量称量的相对标准不确定度[urel（m）]对试样质量称量的准确度进行评价，考虑的不确定度分量包括电子天平检定的不确定度 [u（m检）]和称量重复性的不确定度 [u（m重）]。

电子天平检定不确定度 [u（m检），g]计算公式为：

式中：a为区间半宽度（g）；k为包含因子。

查核试样称量时所用电子天平的检定证书可知，当载荷为0≤m≤50 g时，其检定结果的示值误差为±0.000 2 g；按矩形分布处理，k取；代入公式（2） 进行计算，u（m检） 为0.000 115 g。

称量重复性的不确定度 [u（m重），g]计算公式为：

式中：s为标准偏差（g）；n为称量重复次数（次）。

取同一试样重复称量10次（n=10），试样质量平均值为0.207 1 g；用贝塞尔公式法计算，得到试验标准偏差s为0.004 97 g；代入公式（3） 进行计算，u（m重） 为 0.001 57 g。

试样质量称量的相对标准不确定度[urel（m）]计算公式为：

式中：u（m检）为电子天平检定的不确定度（g）；u（m重）为称量重复性的不确定度；m为样品质量（g）。

将公式（2）、公式（3） 计算所得的数据代入公式（4）进行计算，最终获得试样质量称量的相对标准不确定度urel（m）为0.007 60。

2.2.2 试样消解液定容体积影响评价

试样消解液的定容体积相对标准不确定度[urel（V）]主要受3个因素的影响，包括定容所用容量瓶容量允差引入的不确定度 [u（V差）]、定容溶剂因温差产生体积膨胀引入的不确定度 [u（V温）]以及定容重复性的不确定度 [u（V重）]。

消解液定容所用容量瓶容量允差引入的不确定度 [u（V差），mL]计算公式为：

式中：a为最大容量允差（mL）；k为包含因子。

计算u（V差）时，按照三角形分布处理，k取，代入数值可得u（V差） 为0.012 20。

定容溶剂因温差产生的体积膨胀（环境温度为24℃时） 引入的不确定度 [u（V温），mL]计算公式为：

式中：V为移取体积（mL）；C为水的体积膨胀系数，即2.1×10-4℃-1；T为实验室温差（℃）；k为包含因子。

计算u（V温）时，按照均匀分布处理，k取,代入数值可得u（V温） 为0.003 20。

定容重复性不确定度[u（V重），mL]计算公式为：

式中：s（V） 为定容的标准偏差（mL）；n为定容重复次数（次）。

共重复定容了10次，即n=10，代入数值计算可得 u（V重） 为 0.012 100。

综合3个贡献因子，试样消解液的定容体积相对标准不确定度[urel（V）]计算公式为：

式中：u（V差） 为定容体积误差的不确定度（mL）；u（V温）为定容溶剂因温差产生的体积膨胀的不确定度（mL）；u（V重） 为定容重复性不确定度（mL）；V定为定容体积（mL），在制备消解液时其值为25 mL。

将公式（5） ～公式（7） 的数据代入公式（8）进行计算，urel（V）为0.000 700。

2.2.3 试验溶液中汞的浓度影响评价

试验溶液中汞的质量浓度相对标准不确定度[urel（ρ）]主要受2个因素影响：汞标准工作液中汞的质量浓度相对标准不确定度[urel（ρ1）]；标准曲线拟合荧光值随机变异获得汞的质量浓度相对标准不确定度[urel（ρ2）]。这2个因素又分别受多个因素影响，具体如下。

1） 汞标准工作液中汞的质量浓度相对标准不确定度[urel（ρ1）]

分析汞标准工作液中汞的质量浓度相对标准不确定度[urel（ρ1）]需要考虑多个因素，包括汞标准溶液纯度的相对标准不确定度[urel（C0）]，以及工作液制备中使用的各器皿定容体积相对标准不确定度[urel（V）]。

汞标准溶液纯度引入的相对标准不确定度[urel（C0）]计算公式为：

式中：U为汞标准溶液相对扩展不确定度；k为包含因子。

查标准物质证书可得，汞标准溶液相对扩展不确定度U为1%，k为2。代入公式（9） 进行计算，urel（C0）=0.005。

汞标准工作液中汞的质量浓度相对标准不确定度[urel（ρ1）]计算公式为：

式中：urel（C0）为汞标准溶液纯度的相对标准不确定度；urel（V10）、urel（V50）、urel（V100）、urel（V1）分别为10 mL容量瓶、50 mL容量瓶、100 mL容量瓶和1 mL单标线吸量管的定容体积的相对标准不确定度，计算公式为公式 （8）；n1、n2、n3、n4分别为 10 mL 容量瓶、50 mL容量瓶、100 mL容量瓶和1 mL单标线吸量管的数量（个）。

根据公式（5） ～公式（8），计算汞标准溶液梯度稀释过程中各容器允差、定容温度以及定容重复性引入的不确定度，结果见表3。

表3 汞标准溶液梯度稀释定容体积引入的不确定度Tab.3 Uncertainty introduced by gradient dilution volume of mercury standard solution

根据表3数据，代入公式（10）进行计算，urel（ρ1）为0.008 36。

2）标准曲线拟合荧光值随机变异的汞含量[urel（ρ2）]

为确定荧光值随机变异引入的不确定度，将配制好的标准系列溶液进行原子荧光光度计检测，将相应的荧光值（Y）采用线性最小二乘法进行拟合，得到拟合曲线的线性回归方程为：

该回归方程的线性相关系数r为0.999 6。

该标准曲线的标准差 [s（Y）]计算公式为：

式中：Yi为第i次测量的荧光值；a为截距，其值为61.327 1；b为斜率，其值为3 394.457 9；Ci为第i次测量对应的质量浓度（ng·mL-1）；n为标准溶液测定的总次数（次），测量6个校准标准溶液样品，每个浓度测3次，即n=18。

标准曲线拟合得到汞的质量浓度不确定度[u（ρ2），ng·mL-1]计算公式为：

式中：s（Y）为标准曲线的标准差；P为样品测定次数（次），其值为10；n为标准溶液测定的总次数（次），测量6个校准标准溶液，每个浓度测3次，即n=18；Ci为第i次测量对应标准曲线上的质量浓度（ng·mL-1）；为试样溶液中汞含量的平均值（ng·mL-1）；为标准系列溶液中汞含量的平均值（ng·mL-1）。

标准曲线拟合荧光值随机变异获得汞的质量浓度相对标准不确定度[urel（ρ2）]计算公式为：

式中：u（ρ2）为标准曲线拟合得到汞的质量浓度不确定度（ng·mL-1）；为试样溶液中汞含量的平均值，其值为 1.567 5 ng·mL-1。

将数值代入公式（14）进行计算，urel（ρ2）为0.003 37。

3）试验溶液中汞的质量浓度相对标准不确定度[urel（ρ）]

综上所述，测试液校准试验过程中试验溶液汞的质量浓度相对标准不确定度[urel（ρ）]计算公式为：

式中：urel（ρ1）为汞标准工作液中的汞含量相对标准不确定度；urel（ρ2）为标准曲线拟合荧光值随机变异获得的汞含量相对标准不确定度。

将2个因数的数据代入公式（15） 进行计算，urel（ρ）为0.009 01。

2.2.4 测量重复性（随机差异）影响评价

式中：sx为标准偏差；n为独立重复测试次数（次）；为平均值。

按照1.3.2，取香菇粉消解液试样（测试液）独立重复测试10次，计算平均值及标准偏差，测量结果见表4。

表4 香菇粉中总汞含量试样数据Tab.4 Sample data of total mercury content in Lentinus edodes powder

根据表4数据，将平均值和标准偏差数值代入公式（16）进行计算，urel（）为0.006 67。

2.2.5 回收率的随机差异影响评价

回收率试验即向试样中加入已知量的被测组分，然后进行测定，检查被加入的组分能否定量回收，以判断分析过程是否存在系统误差。

回收率的随机差异引入的不确定度[urel（R）]计算公式为：

通过回收率重复性试验，计算平均回收率及标准偏差，结果见表5。

表5 回收率试验结果Tab.5 Results of recovery test

根据表5数据，将平均值和标准偏差数值代入公式（17）进行计算，urel（R）为0.011 1。

2.3 各关键影响因素综合评价

2.3.1 相对标准不确定度（urel）

综上，相对标准不确定度（urel）计算公式为：

式中：urel（m）为试样质量称量的相对标准不确定度；urel（V）为试液的定容体积相对标准不确定度；urel（ρ）为试样溶液浓度的相对标准不确定度；urel（x）为测量重复性的相对标准不确定度；urel（R）为回收率随机差异的相对标准不确定度。

从2.2中可知，菇粉总汞测定过程中各因素的相对标准不确定度分别为：urel（m）=0.007 60；urel（V）=0.000700；urel（ρ）=0.00901；urel（）=0.00667；urel（R）=0.0111。将各数据代入公式（18）进行计算，得到合成相对标准不确定度urel为0.017 5。

对5个因素的贡献率进行分析，结果详见图1。

图1 各贡献因子相对不确定度贡献率Fig.1 Contribution rate of relative uncertainty of each contribution factor

如图1所示，urel（R）的贡献率最高，即回收率试验是影响结果准确的主要因素；之后依次为urel（ρ）、urel（m）和urel（），分析可知测试浓度和校正曲线的影响同样较大。

2.3.2 合成标准不确定度（u）

香菇粉中总汞测定过程各贡献因子引入的合成标准不确定度（u） 计算公式为：

式中：urel为合成相对标准不确定度；为总汞含量（mg·kg-1）。

将数据代入公式（19） 进行计算，可得总汞测定过程中合成标准不确定度u为0.003 31 mg·kg-1。

2.4 扩展不确定度（U）评价

扩展不确定度（U）计算公式为：

式中：k为包含因子（取置信区间95%，k=2）

香菇粉中总汞含量（X，mg·kg-1）计算公式为：

代入数值，计算可得扩展不确定度U为0.006 6 mg·kg-1。即香菇粉中总汞含量的检定结果为（0.189 0±0.006 6） mg·kg-1，符合证书规定值，检测准确度高。

3 结论与讨论

测量不确定度是考虑到各种因素对测量的影响所做的修正，是对测量过程是否持续受控，测量结果是否能保持稳定一致的统计控制衡量方法。本研究中使用微波消解-原子荧光法测定香菇粉中的总汞含量为 （0.189 0±0.006 6） mg·kg-1（k=2），在证书规定的范围内，检测结果准确、可信。在测量过程和所使用的设备无变化情况下，该不确定度估计值可应用于今后实验室总汞的结果判定和运用，也是数据溯源依据。

通过对各相对标准不确定度贡献因子进行分析，测试液浓度、校正曲线和回收率检测试验是总汞结果准确性的最主要影响因素。可以通过调整标准曲线浓度范围，从而有效降低不确定度，对准确测量食用菌中总汞含量具有一定的意义。同时检测过程中应注意环境条件的准确控制，人员试验操作水平的持续稳定和规范，必要时增加标准不确定度的自由度，减小各贡献因子的随机差异和系统影响，提高检测水平及可信度。