外生菌根菌的分离与培养的研究进展

王 冉，刘朝贵*，须 建

（1.西南大学园艺园林学院，重庆 400715；2.重庆医药高等专科学校，重庆 401331）

土壤中某些真菌与植物根能够形成具有特定功能和形态的共生体即菌根（Mycorrhiza）[1]，这些真菌被称为菌根菌。其中真菌菌丝在植物根外形成菌丝套的称为外生菌根菌（Ectomycorrhizal Fungi），其菌根特征是真菌菌丝伸入根部细胞的间隙，而不深入到细胞内，真菌菌丝体紧密地包围植物幼嫩的根，形成菌套，有的向周围土壤伸出菌丝，代替根毛的作用。外生菌根菌是温带森林生态系统重要的组成部分，是物质循环和能量流动过程中的关键环节，是森林生态系统进程最活跃的驱动力之一[2]。它与宿主植物形成的外生菌根具有富集养分、帮助宿主植物吸收矿物质、增加对水分的吸收、提高宿主植物免疫能力和改良森林土壤等重要作用[3－5]，这对生态系统的稳定有着极其重要的意义。中国有极为丰富的外生菌根菌资源，例如伞菌类中的红菇属、乳菇属、鹅膏菌属、牛肝菌属以及子囊菌类的块菌属等。大多数外生菌根菌，如松茸、美味牛肝菌、块菌等还有着极高的食（药）用价值，是重要的经济种[6，7]。

在生态系统稳定、社会经济发展方面表现出的巨大研究价值使外生菌根菌受到了国内外微生物、农林业和食用菌研究人员的广泛重视。同时鉴于林木滥伐，森林更新树木品种单一，森林管理方法缺陷等影响外生菌根菌生存的问题的存在[8，9]，使菌根菌在林中的数量及种类逐渐减少，为保护森林的生态资源，研究和开发菌根菌的经济价值成为迫切的目标。外生菌根菌的研究与扩繁首先涉及到的过程是分离与培养。外生菌根菌的分离培养是外生菌根研究和应用的前提与基础，纯菌种的获得也是实现菌根合成的基础及简便的方法。所以通过分离，培养成功获得菌丝体纯培养物无疑会拓展外生菌根菌资源的应用。松茸是一种严格的营养共生型外生菌根菌，生态习性十分特殊，至今尚不能像一般腐生菌那样在完全人工条件下获得子实体，故其菌丝体就成为目前人工培养和加工利用的重要形式，迄今已见多种培养基用于松茸[10]。Danell和Camacho[11]获得了鸡油菌菌丝纯培养方法，在欧洲赤松上人工合成了菌根，并从该菌根苗上收获到了幼小的子实体。松乳菇、红根须腹菌、点柄乳牛肝菌[12，13]等也有纯培养成功的例子。但是目前为止仍有许多外生菌根菌没能分离到菌丝或者菌丝生长特别慢[14-16]，因此能有效促进菌丝体生长的培养条件一直是研究者们所追寻的。本文综述了菌丝体纯培养的一般过程以及迄今为止培养成功的外生菌根菌的关键步骤，旨在为未培养成功的外生菌根菌和进一步的研究提供基础。

1 外生菌根菌的分离

1.1 分离材料的要求

1.1.1 子实体

分离中尽量选择新鲜健康、无病虫害的完整子实体，一般伞菌类选择幼嫩子实体为好。过熟的子实体分离极易污染，或者根本无法萌发菌丝；刚成熟的子实体不易污染，组织块可萌发菌丝体；新鲜未成熟的子实体则较容易分离菌丝体。取其孢子的话，子实体有菌膜的，如红菇、鹅膏菌等最好选用菌膜将破而未破的；没有菌膜的可以选取八成熟的、正在释放孢子的个体。

1.1.2 菌根

应选择鲜嫩，长势良好的菌根进行分离。

1.2 分离方法的选择

外生菌根菌的分离按照分离材料性质不同，主要分为孢子分离法、组织分离法和菌根分离法3种[17，18]。

1.2.1 孢子分离法

孢子分离法指利用真菌所产生的有性孢子（担孢子或子囊孢子）进行纯培养而获得纯种的方法。一般包括单孢分离法和多孢分离法。采用孢子弹射法、褶上涂抹法、勾悬法、贴附法来采集孢子，然后用稀释培养法分离孢子。孢子萌发所形成的菌丝体生理年龄小，生活力旺盛，有利于对原菌种的复壮。孢子分离法的缺陷是操作步骤复杂，容易被污染；可能还会因为孢子休眠难以打破而需要花费很长的实验时间[19，20]，其优良种性难以保持；由于孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重、变异大，同时要求具有较高的实验技术。

1.2.2 组织分离法

组织分离法指利用真菌的子实体、菌索或菌核等部分组织作为分离材料获得纯种的方法。它是基于组织化的菌丝体在适宜的条件下可恢复为绒毛状菌丝生长特性进行的，故其本质属于无性繁殖。此法所获得的菌种能保持原有菌种的优良性状，不易发生变异。该法不仅适合于孢子不易萌发或不能形成孢子的真菌菌种分离，而且对野外采集到的菇类的菌种分离，也不失为一种行之有效的方法。因此，组织分离法在实践中被广泛地应用[18]。

1.2.3 菌根分离法

菌根分离法是指利用外生菌根菌感染的宿主植物膨大的须根作为分离材料获得纯种的方法。国外常用此法来获得菌丝体[21-23]。从菌根中分离菌丝体的主要问题是必须确保菌根处于无污染状态，过去的菌根培养常常将其它污染物误以为是所需的真菌。

在这3种分离方法中，有关外生菌根菌孢子分离法与菌根分离法的报道比较少，而且由于实验技术要求高，在国内鲜有研究人员用这两种方法来获取纯菌种。组织分离法作为应用最为广泛也是最为简便的方法，可以作为外生菌根菌分离方法的首选。本文综述的分离过程即为组织分离。

1.3 分离部位的选择

分离成功与否与所取部位的菌丝组织的结构和类型有关。一般伞菌类的子实体，分离菌盖和菌柄连接处的菌肉组织较好[24，25]，由于菌柄内组织高度分化，再生能力较差，不易分离成功；对于菌褶来说，有内或外菌幕保护的话，可以取菌幕保护下的幼嫩菌褶接种；如果是暴露于空气中的话，则很容易被杂菌污染，即使是幼嫩的组织也不易分离成功。但是对于红菇科真菌，因其菌肉主要由已经失去分生能力的泡囊菌丝组成，很难分离成功，应选择其菌柄内侧接近外表皮处的非泡囊菌丝进行分离。对于块菌目真菌，分离未成熟的造孢组织，比较容易获得成功。

1.4 分离过程的注意事项

1.4.1 分离材料的处理

据食用菌有关资料报道，对于较大易吸水的子实体，分离时不宜用药剂表面消毒和无菌水冲洗，也不用灭菌刀片切开组织，以免水分浸入及刀片对子实体内部的烫伤或污染。可直接采用徒手分离法，再迅速用灭过菌的镊子或解剖刀挑取米粒大小的组织块于培养基上，分离效果十分理想，且方便、简捷且高效[26]。其它子实体可先用无菌水冲洗干净（如块菌），可在冲洗时用小软刷轻刷表面，然后用无菌滤纸吸水，再用75%的酒精或0.1%的升汞进行简单的表面消毒（为保持组织块中孢子菌丝活力不宜对其进行灭菌[27]），最后在超净工作台中徒手分离子实体后接种。

1.4.2 实验容器的选择

培养皿（与试管比）虽具有可供菌丝生长的较大面积和开口大易将组织块接入等特点，但对无菌操作技术也有较高的要求，否则易被杂菌污染；试管（与培养皿、三角瓶、小广口瓶比）口小，污染少，但管口小，接种过程中组织块不易接入导致烫伤甚至烫死，出现萌发率低，再则表面积小，不宜与杂菌分离；三角瓶和小广口瓶兼有培养皿和试管二者的优点，即瓶口较培养皿小、较试管大，组织块较易接入又不被烫伤和污染。可供菌丝生长的面积大于试管而小于培养皿，能使菌丝充分扩展生长，满足了菌种分离的条件要求，达到分离目的[28]。

2 外生菌根菌菌丝体的培养

2.1 培养基的选择

对外生菌根菌纯培养的研究首先要讨论的是培养基。关于外生菌根菌培养基种类的选择有不同的观点。栾庆书等[29]指出培养外生菌根菌的培养基常用的有天然培养基，如PDA、PDMA；半组合培养基HM、MMN、CPAD、CMA等；组合培养基MRD、MMA等。有的学者认为，天然基质组成的培养基，因其含有淀粉和丰富的维生素比人工合成的培养基更有利于外生菌根菌的生长；也有学者认为外生菌根菌在生长过程中分泌胞外酶的能力较弱，对天然培养基中的大分子营养物质利用较差，而较易利用合成培养基中的小分子营养物质，因此在合成培养基上长势较好[30]。

王晓光[31]等的实验表明松茸菌丝体在改良的MMN、改良的菌根菌分离用培养基、改良的PDA培养基中，菌丝生长速度最为旺盛；于富强[24]等对13科、19属、33种真菌进行了菌根真菌分离培养研究，发现修改的PDA培养基和松针、玉米培养基分离成功率较高，适用于多数菌种的分离、培养，是比较理想的菌根真菌分离培养基；Lotti M.[32]等对黑孢块菌、冬块菌、斑点块菌等多种块菌进行菌丝体的分离培养，发现WPM培养基是最有效的培养基；黄光文[33]等首次报道了外生菌根菌的共生培养法，初步研究了一个较好的外生菌根菌菌丝体培养方法，即将宿主的愈伤组织与外生菌根共同培养，可以明显地促进真菌菌丝的萌发和生长，愈伤组织匀浆液也可促进菌丝体早期生长。

综合来看，外生菌根菌在对培养基的要求上差异较大，或者说不同的外生菌根菌可能会有不同的最适于自身的培养基，但目前的研究中一般采用较多的仍是PDA、MMN培养基，然后对它们作一些适当的改进。菌根菌较适宜在添加有维生素类物质的天然基质培养基上生长[34]，如添加B族维生素。由于外生菌根菌与宿主植物有着共生关系，这也可考虑在培养基中加入宿主根部提取液，如叶片提取液等。

牛肝菌类真菌的菌丝多从接种块边缘长出，棉絮质，菌丝浓密，生长速度缓慢；红菇科、鹅膏科和口蘑科真菌菌丝短或长绒状，无或少气生菌丝，生长速度慢，十分不利于进一步的研究和应用。因此进一步筛选合适的培养基，摸索适宜的分离、培养条件，以提高菌丝的生长速度，对于这些生长缓慢的外生菌根菌的基础和应用研究将具有十分重要的意义。

2.2 培养条件的筛选

除了找到适宜的培养基以外，选择合适的培养条件也是菌丝快速、健康生长的关键所在。外生菌根菌的生长依赖于环境中各种生态因子的协调，如土壤养分、温度、pH、湿度及水分等，不同菌种对这些因子的忍受性也影响菌落的生长，其中温度和pH是最重要的影响因子[35]。

2.2.1 温度

菌丝在生长过程中对温度的改变是非常敏感的[36]，温度是影响外生菌根真菌生长和生理代谢的生态因子中最重要的因素之一。大部分的外生菌根菌适宜生长温度约8℃～27℃左右，但不同温度的生长速率与生长曲线模式可显示出最佳和不良的菌落生长温度。毕国昌[37]研究了38种外生菌根菌在不同温度下的生长状况，发现大多数菌株自15℃起，菌落生长就迅速加快，到22℃或27℃时，生长速度达到最大。绝大部分菌株的最适生长温度为25℃，少数菌种为22℃，还有一些菌株则为27℃。

国立台湾大学的胡弘道教授[38，39]研究了温度对块菌在洋菜培养基上生长的效应，结果显示不同温度对台湾块菌、印度块菌、法国黑孢块菌、意大利白块菌以及拟外孔块菌皆呈极显著差异，且最佳温度皆为25℃，最差温度为33℃。国内一些研究人员也对各种外生菌根菌适宜生长的温度进行了初探[40，41]。

2.2.2 pH值

pH值影响到了培养介质中菌根真菌的生长[42]。外生菌根菌比较适宜偏酸性的环境，一般最适pH值为4～6，大多数外生菌根菌能忍受的最低pH值为3[43]。尽管有部分菌根真菌其生长最适pH是在碱性条件下，但它们对酸性条件表现出较强的适应能力，这类菌根真菌生长适宜的pH范围较广[44]。胡弘道教授[38，39]的实验结果表明台湾块菌与印度块菌最适pH为6左右，法国黑孢块菌pH为6，意大利白块菌pH为5，拟外孔块菌则不呈现显著差异。我国的韩桂云等研究表明19种菌根菌有较广的pH适应范围[40]。

研究温度、pH这些生态因子对外生菌根菌菌丝体的生长发育的影响，总结温度、pH的适宜范围，以便了解不同外生菌根菌的生物学特性及其生理适应能力，进而探讨它们生长发育与生态分布之间的关系，为今后在林业生产实践中因地制宜，广泛应用菌根技术提供依据。

3 总结与展望

近几十年来，国内外对外生菌根菌的研究如火如荼地进行着，至今已在很多研究领域取得了突破性的进展，获得了可喜的成果。在中国，虽然对外生菌根菌的研究起步较晚，但发展迅速，至今已获得一些超过世界水平的研究成果，然而外生菌根菌的研究任重道远，在人工驯化方面遭遇的瓶颈使对其的深入研究势在必行。从基础研究着手，不断成熟，完善实验技术，希望能从中找到突破口，使外生菌根菌资源得到真正的扩展利用。

在归纳了外生菌根菌的分离与培养后，对此研究提出两点建议，希望能找到更加合适的菌丝生长模式。一是外生菌根菌分离方法单一，孢子分离法与菌根分离法的技术有待提高与普及；二是发展液体深层发酵技术，寻求菌丝快速生长的有效方法。

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