部分稀土元素对桑黄液体发酵的影响*

姚 强，高兴喜，宫志远**，游鲁蒙，任鹏飞，刘 岩，韩建东，任海霞

（1.山东省农业科学院农业资源与环境研究所，山东 济南 250100；2.鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025；3.青岛农业大学生命科学学院，山东 青岛 266109）

桑黄 （Phellinus igniarius）是一种珍贵的大型药用真菌，属担子菌亚门 （Basidiomycotina）、层菌纲 （Hymenomycetes）、 多孔菌目 （Polyporales）、 锈革孔菌科 （Hymenochaetacae）、 针层孔菌属 （Phellinus）。 目前， 国际上公认桑黄是生物抗癌领域中效果最好的真菌[1]。现代药理学研究表明，桑黄具有抑制肿瘤、提高免疫力、抗氧化、保肝护肝等多种药用功效[2-5]，其关键药效成分为多糖、三萜和黄酮类物质[6]。目前，国际市场对桑黄需求很大，而野生桑黄资源几近枯竭，桑黄的人工栽培也只在小规模上获得成功，因此，采用液体发酵技术进行桑黄的规模化生产具有广阔的前景[7]。

稀土元素由于其特殊的理化性质，在工农业生产及医药卫生行业有着广泛的应用。稀土元素不但能够促进植物的生长，还能促进植物细胞次生代谢产物的合成[8，9]。近年来，稀土元素在食用菌生产上的应用也日渐广泛，稀土元素 （或稀土微肥）能够促进蒙古口蘑、杏鲍菇、灵芝等食用菌的菌丝生长，对红菇多糖深层发酵也具有一定的促进作用[10-13]。目前，稀土元素在桑黄液体发酵上的应用研究还未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料

桑黄 （P.igniarius）菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号：CGMCC 5.95。

稀土元素硝酸镧、硝酸铈、硝酸钕、硝酸镨、硝酸铒，购自天津市光复精细化工研究所。香兰素购自上海生工生物工程服务有限公司，齐墩果酸标准品购自烟台市药品检验所，其它试剂为普通分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化与发酵培养

将桑黄斜面菌种在PDA平板上活化，25℃培养7 d左右，待长满平板后，用打孔器打取菌块接种于200 mL PDB培养基，25℃、150 r·min-1振荡培养5 d~7 d，制备液体菌种用于下一步发酵实验。

分别配制含有各稀土元素浓度梯度为0、0.001mmol·L-1、0.01 mmol·L-1、 0.1 mmol·L-1、 1.0 mmol·L-1的 PDB 培养基（500 mL三角瓶装液量200 mL），每个浓度3个重复，高压蒸汽灭菌。然后按5%的接种量将桑黄种子液接入各培养基中，置于25℃、150 r·min-1的摇床中进行发酵培养，培养时间为7 d左右。

1.2.2 桑黄生物量的测定

发酵结束后收集菌丝体，并用去离子水洗涤菌体3次，65℃烘干至恒重后测量干重。

1.2.3 活性物质的提取与检测

多糖的提取与检测按文献 [14]方法进行。

三萜的提取与检测按文献 [15]方法进行。

黄酮的提取与检测按文献 [16]方法进行。

2 结果与分析

2.1 稀土元素对桑黄生物量的影响

将稀土元素用于桑黄的液体发酵，在一定程度上可促进其生物量的积累，结果如图1所示。

从图1中可以看出，在培养基中添加稀土元素铈和铒有利于桑黄生物量的提高，其中铈在浓度0.01 mmol·L-1时诱导效果最好，此时桑黄菌体生物量达到最大值（5.85±0.14）g·L-1，比没有添加稀土元素的对照组提高了23%，而稀土元素铒在浓度为0.1 mmol·L-1时也表现出较好的诱导效果， 使桑黄菌体生物量达到 （5.34±0.45）g·L-1，比对照组提高了13%。相比较而言，其它几种稀土元素对桑黄生物量未能表现出明显的促进作用，甚至稀土元素钕还表现出一定的抑制作用，这表明稀土元素对桑黄生物量积累的影响与稀土元素的种类有关。

2.2 稀土元素对桑黄胞内多糖生产的影响

不同稀土元素对桑黄胞内多糖生产也产生了不同程度的影响，结果如图2所示。

从图2中可以看出，稀土元素镧、铈、钕在一定浓度下可以促进桑黄胞内多糖的合成，提高胞内多糖的产量。桑黄胞内多糖的合成对稀土元素铈的作用比较敏感，铈在较低浓度 （0.001 mmol·L-1）就明显促进了胞内多糖的合成，并在浓度为0.01 mmol·L-1时，桑黄胞内多糖产量达到 （737.86±2.71）mg·L-1， 比对照组提高了 34%； 而稀土元素钕和镧只有在较高浓度时才表现出较强的诱导作用，分别在浓度0.1 mmol·L-1和 1.0 mmol·L-1时使桑黄胞内多糖的产量达到 （789.09±2.09）mg·L-1和 （760.80±1.31）mg·L-1，比对照组提高了45%和38%；稀土元素镨和铒对桑黄的胞内多糖的合成不但没有表现出促进作用，反而有明显的抑制作用。

2.3 稀土元素对桑黄胞外多糖生产的影响

稀土元素对桑黄胞外多糖产量的影响见图3。

稀土元素对桑黄胞外多糖合成的影响表现出与胞内多糖类似的结果，从图3可以看出对桑黄胞外多糖合成具有促进作用的稀土元素仍然是镧、铈和钕，而稀土元素镨和铒则表现出抑制作用。稀土元素铈在浓度为0.01 mmol·L-1时， 桑黄胞外多糖产量达到最大值 （610.36±0.31）mg·L-1，比对照组提高了117.05%，而稀土元素镧和钕在浓度为0.1 mmol·L-1时均表现出较好的诱导效果，分别使桑黄胞外多糖产量达到 （587.27±0.31）mg·L-1和 （477.38±0.91）mg·L-1，比对照组提高了108.84%和69.76%。

2.4 稀土元素对桑黄胞内三萜生产的影响

稀土元素对桑黄胞内三萜生产的影响见图4。

图4 不同稀土元素对桑黄胞内三萜生产的影响

稀土元素对桑黄胞内三萜合成的影响也因稀土元素种类和浓度的不同，呈现出不同的变化趋势，由图4可以看出，稀土元素镧、铈、钕在一定浓度下对桑黄胞内三萜的代谢具有一定的促进作用，可提高胞内三萜产量。其中稀土元素铈在浓度为0.01 mmol·L-1时，桑黄胞内三萜产量达到 最大 值 （10.70±2.92）mg·L-1， 比 对照 组 提 高 了27.25%；稀土元素镧在浓度为0.001 mmol·L-1时，桑黄胞内三萜的产量为 （104.86±1.02）mg·L-1， 比对照组提高了25.05%；稀土元素钕在浓度为0.01 mmol·L-1时，桑黄胞内三 萜产 量为 （95.47±2.63）mg·L-1， 比 对 照 组 提 高13.86%。稀土元素镨和铒对桑黄的胞内三萜的代谢，不但未表现出促进作用，反而有明显的抑制作用。

2.5 稀土元素对桑黄胞外三萜生产的影响

稀土元素对桑黄胞外三萜生产的影响与胞内三萜呈现不同的变化趋势，结果见图5。

从图5可以看出，5种稀土元素镧、铈、钕、镧、铒在一定的浓度下对于桑黄胞外三萜物质的代谢，均具有一定的促进作用。其中作用效果最好的为稀土元素镧，在其浓度为 0.01 mmol·L-1时，胞外三萜产量达到最大值（88.99±0.89）mg·L-1， 比对照组提高了 4.08倍； 稀土元素钕和镨也均在浓度为0.01 mmol·L-1时达到最佳诱导效果，分别使桑黄胞外三萜含量达到 （56.38±0.82）mg·L-1和（47.90±1.90）mg·L-1， 比对照组提高了 2.23倍和 1.75倍。稀土元素铈和铒对桑黄胞外三萜代谢有一定的促进作用，但促进作用不如上述3种元素显著。

2.6 脂肪酸对桑黄黄酮类物质生产的影响

桑黄是少有的可产生黄酮类物质的药用真菌，不同脂肪酸对桑黄黄酮生产的影响见图6。

从本实验结果来看 （图6所示），所考察的几种稀土元素均对桑黄黄酮的合成表现出一定的诱导作用。其中稀土元素钕诱导效果最好，在浓度0.001 mmol·L-1使桑黄黄酮产量达到最大值 155.30 mg·L-1，比对照组提高了59.69%；其次，诱导效果较好的稀土元素分别为铒、铈和镨， 并分别在浓度 0.001 mmol·L-1、 0.001 mmol·L-1和 0.01 mmol·L-1时达到最佳诱导效果，使黄酮产量分别达到147.80 mg·L-1、 139.40 mg·L-1和 134.70 mg·L-1。 稀土元素镧也在浓度0.001 mmol·L－1时，对桑黄黄酮的生产表现出一定的促进作用，但诱导效果要较其它几种稀土元素弱很多。

3 结论与讨论

稀土元素在食用菌上的应用，最初是以稀土微肥的形式用于食用菌的栽培，用来提高食用菌产量和品质[18，19]。近年来，人们将特定的稀土元素用于食用菌的液体发酵，以考察对其有效成分积累的影响[12，20]，并取得理想的实验结果。本文将稀土元素用于桑黄的液体发酵，来考察对桑黄药用成分合成的影响。实验结果表明，稀土元素对桑黄生物量的积累以及活性成分合成的影响，与稀土元素的种类和浓度密切相关。综合来看，稀土元素铈和铒有利于桑黄生物量的积累，而稀土元素铈、钕和镧则对桑黄胞外多糖、胞内多糖和胞内三萜的合成具有显著的促进作用。虽然本文所考察的几种稀土元素都对桑黄胞外三萜以及黄酮的合成具有一定的促进作用，但稀土元素镧、钕和镨对胞外三萜的诱导效果相对较好，而钕、铒和镨则对黄酮诱导效果相对较好。李增利在研究稀土元素对红菇多糖液体发酵的影响时也得出了类似的结论[12]。相对于桑黄多糖等活性成分的生产，桑黄生物量对稀土元素的诱导作用不甚敏感，这与郭丽琼[19]、李增利[12]的研究结果基本一致。

稀土元素的作用机制可能类似于激素，因其具有类似钙的原子结构特征和理化性质，可通过激活相应的酶系统而发挥作用[9，12]。然而，当稀土元素的浓度过高时，会呈现类似重金属离子的特性，并与膜蛋白结合抑制有关酶的活性[9]。本研究中，稀土元素镨和铒等对桑黄胞多糖、稀土元素镧和钕对黄酮的合成表现出的抑制作用，可能正是缘于此。

D’Aquino在研究稀土元素对木霉菌的生长影响时发现，稀土元素对木霉菌生长的影响作用具有种的特异性，而且稀土元素混合使用还体现出协同作用效果[21]。在本研究中，不同的稀土元素对桑黄菌丝的生长以及活性物质的积累诱导表现出不同的作用效果，可能也是由于稀土元素对桑黄发挥作用具有种的特异性。另外，本研究未考察稀土元素混合物对桑黄生长和活性物质积累合成的影响，郭丽琼[19]和张金桐[18]在研究稀土元素混合物 （稀土微肥）对灵芝生长和品质影响时发现，稀土元素混合物能够显著促进灵芝菌丝的生长并改善灵芝的品质。

本研究仅就稀土元素对桑黄菌丝生长以及桑黄活性物质合成的影响进行了初步探讨，而对稀土元素的作用机制还有待于进一步的深入研究。

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