松杉灵芝提取物体外抗氧化活性的研究

孙巍巍，包海鹰

（吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118）

松杉灵芝 （Ganoderma tsugae Murr.） 为担子菌纲 （Basidiomycetes）、 多孔菌目 （Polyporales）、 多孔菌科（Polyporaceae）、灵芝属 （Ganoderma）真菌，子实体一年生，是1种珍贵的药用真菌。灵芝具有多种活性物质，其中多糖和三萜被认为是主要药效成分。大量报道表明灵芝具有广泛的药理作用，例如保肝、抗肿瘤、抗微生物、抗高血压、抗HIV－1及HIV－l蛋白酶、镇静、抗疲劳、耐缺氧、抗氧化作用等[1]，有学者对松杉灵芝子实体热水提取物和甲醇提取物的抗氧化性进行研究，结果表明这两种提取物都具有较好的抗氧化活性[2，3]。本实验采用3种方法对松杉灵芝子实体不同有机溶剂提取物进行体外抗氧化活性研究，为松杉灵芝的药用价值开发提供理论基础。

1 实验材料

1.1 材料

松杉灵芝子实体采自吉林省长白山，由吉林农业大学菌物研究所图力古尔教授提供并鉴定。

1.2 主要仪器设备

PL303电子天平，梅特勒－托利多仪器有限公司；HH CP－O1W二氧化碳细胞培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TU－1800紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；Polytron组织匀浆器，上海东富龙有限公司；GL－20G－Ⅱ离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.3 实验试剂及药品

1,1－二苯基－2－苦基肼自由基 （·DPPH） 和细胞色素C（CytC）均购自Sigma公司；抗坏血酸 （Vc）为食品级；三羟甲基氨基甲烷 （Tris）、FeSO4、 三氯醋酸 （TCA）、 硫化巴比妥酸 （TBA）、 无水乙醇、CuSO4、 Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O和硫脲等均为分析纯。

2 方法

2.1 供试药品的制备

将1.5 kg松杉灵芝子实体粉碎，依次用石油醚、氯仿、甲醇和蒸馏水回流提取3次，除了石油醚的提取温度是35℃外，其它提取温度均为60℃，每次提6 h，合并提取液，过滤，浓缩，干燥，分别得到石油醚提取物、氯仿提取物、甲醇提取物和水提取物。称取松杉灵芝石油醚提取物、氯仿提取物、甲醇提取物、水提取物各100 mg，分别用氯仿、氯仿、甲醇和蒸馏水定容于50 mL容量瓶中，配成浓度为2 mg·mL-1的样品母液，然后将样品母液用溶剂逐级稀释成浓度为 2 mg·mL-1、 1 mg·mL-1、 0.5 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、 0.125 mg·mL-1、 0.0625 mg·mL-1的样品溶液待用。

2.2 抗氧化试剂的配制

2.2.1 清除·DPPH自由基试剂的配制

·DPPH溶液：准确称取0.01 g的·DPPH，用无水乙醇定容至50 mL容量瓶中作为母液，取10 mL母液用无水乙醇定容于50 mL容量瓶中，最终浓度为0.04 mg·mL-1，避光，现用现配。

2.2.2 大鼠脑匀浆脂质过氧化试剂的配制

Tris-HCl缓冲液 （20 mmol·L-1， pH7.4）： 称 Tris 0.24228 g，加 50 mL蒸馏水，HCl 0.17 mL，稀释到 50 mL， 取 HCl 42 mL与 50 mL Tris混匀备用；FeSO4·7H2O（10 μmol·L-1）溶液： 称 FeSO4·7H2O 0.0508 g， 加 10 mL Tris-HCl缓冲液 （20 mmol·L-1， pH7.4）， 用时稀释 1000倍；0.1 mmol·L-1的 Vc溶液： 取 Vc 0.0176 g， 加 10 mL Tris-HCl缓冲液 （20 mmol·L-1， pH7.4）， 用时稀释 100倍；三氯醋酸 （TCA 28%）溶液：称三氯醋酸2.8 g，加10 mL Tris-HCl缓冲液；硫代巴比妥酸 （TBA 1%）溶液：称 TBA 0.2 g，加 20 mL Tris-HCl缓冲液；阳性对照（BHA 500 μg·mL-1）： 准 确称 取 BHA 50 mg， 加 10 mL Tris-HCl缓冲液。

2.2.3 清除羟自由基试剂的配制

磷酸钠盐缓冲液 PBS （0.15 mmol·L-1， pH7.4）： 取Na2HPO4·12H2O 0.0042 g， 加入蒸馏水77.4 mL， 取NaH2PO4·2H2O 0.0023 g， 加蒸馏水 100 mL， 从中取 22.6 mL与上列溶液混匀，可放于4℃冰箱保存；Vc（100 μmol·L-1）溶液：称Vc 0.0176 g，加10 mL磷酸钠盐缓冲液 （0.15 mmol·L-1， pH7.4）， 用时稀释 100 倍； CuSO4（100 μmol·L-1）溶液： 称取 CuSO4·5H2O 0.039 g， 加10mL 磷酸钠盐缓冲液 （0.15 mmol·L-1，pH7.4）， 用时稀释 100倍；细胞色素 C （12 μmol·L-1）： 每2毫升 15 mg， 稀释 50 倍备用； 阳性对照 （硫脲2 μg·mL-1）： 称硫脲2 mg， 加磷酸钠盐缓冲液 （0.15 mmol·L-1， pH7.4）10 mL， 用时稀释100倍。

2.3 抗氧化的测定

2.3.1 清除·DPPH自由基的测定

将石油醚提取物、氯仿提取物、甲醇提取物、水提取物溶液分别分为A、B、C三组。A组：2 mL样品溶剂和2 mL·DPPH溶液；B组：2 mL样品溶液和2 mL·DPPH溶液；C组：2 mL样品溶液和2 mL无水乙醇。加入反应液后摇匀，于室温避光静置30 min，转移至比色皿内，在517 nm处测定吸光度值。每组做6个平行，计算各样品对·DPPH的清除率[4]。各样品对·DPPH自由基的清除能力(SA)公式为:

SA=[A-(B-C)]/A×100%

式中：A、B、C分别为A组、B组、C组所测得的吸光度值。

2.3.2 大鼠脑匀浆脂质过氧化作用的测定

大鼠用乙醚麻醉至昏迷，快速断头处死后，迅速剥离脑组织，4℃生理盐水反复冲洗，洗去血污，滤纸吸去生理盐水，称脑重量。将脑剪成小块后，用Polyron电动匀浆器， 加入冰冻 Tris-HCl缓冲液 （20 mmol·L-1，pH7.4）得1/10（重量体积比）脑匀浆，冰浴中迅速用匀浆机以18000 r·min-1的速度，打浆3次，每次10 s，间隔30 s，制备成脑匀浆 （1∶10， w·v-1）， 4℃离心 （2000 r·min-1， 20 min），将匀浆中的上清液均分为1 mL，加入1 mL待测样品， 1 mL 10 μmol·L-1的 FeSO4和 1 mL 0.1 mmol·L-1的 Vc的试管中，于37℃保温1 h，保温结束后，加入1.0 mL三氯醋酸 （TCA，28%）终止反应，再加1.5 mL硫化巴比妥酸 （TBA，1%），于100℃加热15 min，离心除去蛋白质后，于532 nm测定丙二醛 (MDA)-TBA复合物的吸光度， 抑制率 （P） 公式[5]为：

P=(A-A1)/A×100%

式中：A为对照的吸光度；A1含待测样品体系的吸光度。

2.3.3 羟自由基清除活性的测定

精密量取 3.0 mLPBS （0.15 mmol·L-1， pH7.4， 下同）和30μL CuSO4于试管中，混匀作空白参比管；精密量取PBS 3.0 mL、 CuSO430μL、 维生素 C 30μL、 细胞色素 C 60μL、蒸馏水0.5 mL作为对照；精密量取PBS 3.0 mL，CuSO430μL、 维生素 C 30μL、 细胞色素 C 60μL， 各待测样品0.5 mL作为待测组；精密量取PBS 3.0 mL、CuSO430μL、 维生素 C 30μL、 细胞色素 C 60μL、 硫脲 3μL作为阳性对照。将上述试管同时置于25℃恒温水槽中保温90 min后，在550 nm测吸光度值A。每处理重复5次，硫脲作为阳性对照，将空白抑制率视为100%。羟自由基清除活性 （A） 公式[6]为：

A=(T-T2)/(T-T1)×100%

式中：T为羟自由基 （·OH）产生体系的透光值；T1为对照体系 （无·OH）的透光值；T2为含待测样品体系的透光值。

3 结果与分析

3.1 清除·DPPH的测定

松杉灵芝提取物清除·DPPH自由基的情况见表1。

实验结果如表1所示，各提取物都具有一定清除·DPPH活力的能力，随着提取物浓度的增加，清除率增高，可见提取物的抗氧化性与提取物的浓度呈量效关系。甲醇组的抗氧化能力略高于水组，在2 mg·mL-1时的清除率分别为68.73%和65.28%；石油醚组次之，最大清除率为57.78%；氯仿组清除·DPPH的能力最低，最大清除率为51.56%。

表1 松杉灵芝提取物清除·DPPH自由基的能力

3.2 体外大鼠脑匀浆脂质过氧化作用的测定

松杉灵芝提取物对脂质过氧化的抑制情况见表2。

从表2中可知，各层提取物的抑制率都随浓度的提高而增大，各提取物都具有抑制脂质过氧化效果，甲醇层的抑制能力最强，在2 mg·mL-1时的抑制率为64.55%，稍高于水层的最大抑制率59.72%，然后依次是石油醚层和氯仿层，两者的最大抑制率相近，分别为55.63%和49.31%。在浓度为 0.5 mg·mL-1时，阳性药 BHA的抑制率达到81.71%，抑制作用均大于松杉灵芝各层提取物。

表2 松杉灵芝提取物对脂质过氧化的抑制能力

3.3 羟自由基清除活性的测定

松杉灵芝提取物清除羟自由基能力见表3。

表3 松杉灵芝提取物清除羟自由基能力

从表3可以看出，各提取液都具有清除·OH能力，且都具有较好的量效关系。水层的清除能力最强，在浓度为2 mg·mL-1时的清除率达到100%，其余各组的的最大清除率分别为甲醇层81.26%、氯仿层75.07%、石油醚层60.34%。阳性药硫脲在浓度为 2 μg·mL-1时的清除率为76.78%，水层和甲醇层在2 mg·mL-1时清除·OH的能力均超过阳性药，尤其是水层具有极好的清除效果。石油醚层的清除效果最弱，在浓度达到1 mg·mL-1时，清除率随浓度的增大不再明显提高。

4 小结与讨论

松杉灵芝不同溶剂提取物都具有较好的抗氧化作用，并且随着提取物浓度的增加，抗氧化作用也逐渐增强。各组对·DPPH的清除能力：甲醇组＞水组＞石油醚组＞氯仿组；对脂质过氧化的抑制能力：甲醇组＞水组＞石油醚组＞氯仿组；对·OH的清除能力：水组＞甲醇组＞氯仿组＞石油醚组。在清除·DPPH的实验中，各层的提取物均具有清除·DPPH的能力，·DPPH是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能够清除它，则提示受试物具有减低羟基自由基、烷基自由基或过氧自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用[7]；在抑制脂质过氧化的实验里，各层提取物均具有一定的抑制作用，可能与各提取物中含有酚类、三萜类、多糖类等抗氧化物质的含量及组成有关；在清除·OH的实验中，有学者研究表明松杉灵芝子实体热水提取物对羟自由基具有很好的清除力[2]，与本实验中水层对羟自由基具有很好的清除效果相符，表明松杉灵芝提取液清除·OH的物质极性较大，能更多溶于水和甲醇中。从以上抗氧化实验推测，不同溶剂提取物清除自由基的种类不同，说明其抗氧化组份不同，在甲醇组中清除·DPPH和抑制脂质过氧化的物质多，在水层中清除·OH的物质多，由于提取液成分复杂，各物质之间可能相互影响，具体的清除物质成分还需近一步研究。众所周知，自由基损伤参与多种疾病的病理生理过程，如炎症、免疫失调、动脉粥样硬化、恶性肿瘤、衰老等，研究和开发抗氧化剂和自由基清除剂对疾病的防治有重大意义。目前国内外也已将抗氧化检测用于抗衰老等保健食品的评价，对保健食品的开发具有积极作用。由此可见，松杉灵芝在抗氧化、抗衰老等方面有较大的可挖掘潜能。

[1]陈静，夏永辉，梁玲.灵芝有效成分生物活性作用的研究进展[J].云南中医中药杂志，2009，30(1)：61-62.

[2]Mau JL,Tsa SY,Tseng YH,et al.Antioxidant properties of hot water extracts from Ganoderma tsugae Murrill[J].Food Science and Technology,2005,38(6):589-597.

[3]Mau JL,Tsa SY,Tseng YH,et al.Antioxidant properties of methanolic extracts from Ganoderma tsugae[J].Food Chemistry,2005,93(4)：641-649.

[4]丹辉.娑罗子皂苷类成分及药理活性研究[D].长春：吉林农业大学，2008.

[5]刘方，武子斌，牛淑敏，等.中药材抗氧化及自由基清除活性的研究[J].中国药学杂志，2001，36(7)：442-445.

[6]李岩.刺榆的生药学及药理活性的研究[D].长春：吉林农业大学，2008.

[7]李红，张元湖.应用DPPH法测定苹果提取物的抗氧化能力[J].山东农业大学学报：自然科学版，2005，36(1)：35-38.