基于ITS序列分析对秦岭冷水沟羊肚菌的鉴定*

戴 璐，李峻志，李安利，祁 鹏，丁仕刚

（1.陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043；2.宁陕县科技局，陕西 宁陕 711600）

羊肚菌是世界最稀有的野生食用菌之一，不仅味道独一无二，且营养价值很高，有 “食用菌皇后”美誉[1－3]。秦岭因其得天独厚的生态环境成为野生羊肚菌的重要产区。本研究以采自秦岭中段宁陕县冷水沟的10株羊肚菌为研究对象，对其进行了分离、纯化和ITS区序列分析，从分子水平对样品进行了鉴定。

1 材料与方法

1.1 菌株

羊肚菌样品 QM－1、 QM－2、 QM－4、 QM－5、 QM－6、QM－7、 QM－12、 QM－14、 QM－15和 QM－16， 采自秦岭中段宁陕县冷水沟，海拔997 m～1200 m。10个样品的子实体形态见图1。

1.2 实验方法

1.2.1 孢子弹射法分离菌丝体

将采集到的子实体清理干净，无菌操作切下约1 cm2菌盖，并用凡士林粘于PDA平板的皿盖中央，25℃恒温倒置培养1 d～2 d。待弹射至培养基上的孢子萌发长出菌丝时，用接种铲取至PDA平板上继续培养。转接菌丝到新的PDA板，直至没有杂菌污染。铲取约0.5 cm2×0.5 cm2大小的菌丝块，置于铺有灭菌玻璃纸的PDA平板中央，25℃培养7 d至菌丝长满平板。

图1 秦岭冷水沟采集的10株秦岭羊肚菌子实体

1.2.2 菌丝体基因组DNA的提取和ITS区序列的扩增

收集菌丝，用新型植物基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）提取样品基因组DNA，并保存于4℃。PCR扩增 ITS区， 引物为 ITS1：5’－TCCGTAGGTGAACCT GCGG－3’和 ITS4： 5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3’[4]，由北京奥科生物技术有限责任公司合成。50μL反应体系：引物各 2μL、 模板 2μL、 2×PCRmix （润德生物技术有限公司）25μL、 ddH2O 19μL。 反应条件： 94℃ 2 min； 94℃1 min， 55℃1 min， 72℃2 min， 30个循环； 72℃10 min。用1%的1×TAE琼脂糖凝胶以DL2000为marker，对PCR产物进行电泳 （60 V，40 min）检测。

1.2.3 ITS区序列分析和系统树构建

以PCR产物直接测序，由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。用DNAman对序列进行拼接，并对两端进行修剪。将序列在GenBank上进行BLAST分析，利用软件Clustal X进行同源性比较，MEGA4.1绘制分子系统树。

2 结果与讨论

2.1 ITS区PCR扩增结果

ITS区PCR扩增结果见图2。

图2 ITS区PCR扩增产物电泳图 （M:DL2000)

由图2可见， PCR扩增出的目的片段条带单一清晰，大小在1000 bp和2000 bp之间。序列经DNAman拼接后，大小均为1200 bp左右。QM-1为1247 bp，QM-2为1125 bp，QM-4为1182 bp，QM-5为1134 bp，QM-6为1160 bp， QM-7为1180 bp， QM-12为1193 bp，QM-14为1189 bp，QM-15为1145 bp，QM-16为1215 bp。

2.2 BLAST比对分析结果

在GenBank数据库中，将所得序列进行BLAST分析，发现10株羊肚菌ITS区序列都与粗腿羊肚菌 （Morchella crassipes，又名皱柄羊肚菌）的ITS区序列相似性最大，达到 97%～98%。QM-1、QM-16与登录号为 AJ539482.1的粗腿羊肚菌的ITS序列，QM-2与FJ860052.1，QM-4、QM-12、 QM-14 与 AJ623265.1， QM-5、 QM-6、 QM-7、QM-15与EU701002.1的序列相似性最大，即BLAST结果表明10株样品都为粗腿羊肚菌。

2.3 基于ITS区序列的系统树

把10个样品的ITS序列与GenBank中的黑脉 （小顶）羊肚菌 （Morchella angusticeps Peck）、 尖顶羊肚菌 （M.conica Fr.）、 红褐羊肚菌 （M.rufobrunnea）、 高羊肚菌 （M.elata Fr.）、肋脉羊肚菌 （M.costata）的ITS序列进行比对，并用MP法构建分子系统树，见图3。

图3 基于ITS序列的分子系统树 （MP法，Bootstrap验证，重复1000次）

从分子系统树可以看出，黑脉 （小顶）羊肚菌DQ257338、尖顶羊肚菌GQ304964、高羊肚菌GQ228473、肋脉羊肚菌EF080998、红褐羊肚菌DQ355921聚为外群，而10株样品聚为1枝，说明样品与这几种羊肚菌有一定的遗传距离，但样品彼此之间的遗传关系很近。10株样品内又分为3个小类群，说明即使同为粗腿羊肚菌也可能因为海拔、植被等环境因素的不同导致遗传变异，ITS序列表现出差异。

3 结论

以ITS区作为信号分子对秦岭冷水沟采集的羊肚菌进行鉴定，发现10株样品都为粗腿羊肚菌 （Morchella crassipes）。rDNA的ITS区同时具有多变区和保守区，18S、5.8S和28S的序列在进化中趋于保守，种间变化小，而内转录间隔区ITS1和ITS2作为非编码区，最终不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较小，进化速度快，种间差异大，且变异速度存在着较大的差异，适合种及种以下水平的分类研究[5]。从分子系统树看来，本研究中的10株粗腿羊肚菌与同属其他种羊肚菌ITS区序列具有较大差异，但同时这10株粗腿羊肚菌也分为3个小类群，推测可能是因为海拔、植被等环境因素的不同，粗腿羊肚菌与环境相互作用中协同进化[6]而导致种内ITS区序列的差异，这种种内差异还有待将来收集更多的样品进一步深入研究。

[1]谢占玲，谢占青.羊肚菌研究综述[J].青海大学学报：自然科学版， 2007， 25(2)： 36-40.

[2]李华，包海鹰，李玉.羊肚菌研究进展[J].菌物研究，2004，2(4)：53-60.

[3]李烨，温鲁.羊肚菌的研究与开发[J].中国食用菌，2004，23(1)：6-8.

[4]White TJ,Bruns T,Lee S,et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics in PCR protocols:a guide to methods and applications[M].San Diego:CA.Academic Press,1990:315-322.

[5]陈凤毛.真菌ITS区序列结构及其应用[J].林业科技开发，2007，21(2)：5-7.

[6]Bergius N,Danell E.The Swedish matsutake (Tricholoma nauseosum syn.T.matsutake):distribution,abundance,andecology,scandinavian[J].Journal of Forest Research,2000(15):318-325.