副猪嗜血杆菌的分离鉴定与生物学特性研究

段笑笑 邴啟政 张严琦 王 媛 刘 倩 马 帅 李 彦

（青岛市动物疫病预防控制中心， 山东青岛 266000）

副猪嗜血杆菌（Haemophihlsparasuis, HPS）为巴氏杆菌属短小杆菌，革兰氏染色阴性，存在于健康猪上呼吸道，特别是鼻黏膜和扁桃体区域[1]。菌株移行到肺部则引起肺炎，从而引发全身性疾病，特征性临床症状为纤维素性浆膜炎、关节炎、脑膜炎等，被称为Glasser's 病[2]。副猪嗜血杆菌病在断奶前后和保育期仔猪中多发，尤其与蓝耳病、圆环病毒2 型混合感染时，发病率与死亡率都较高，是给我国养猪业中造成严重的经济损失的猪疫病之一。

副猪嗜血杆菌分离较困难，死亡病例中较难分离，一般采用具有典型临床症状、濒临死亡、未用抗生素治疗的病猪，无菌采集其关节液、心包液、胸腔积液等，并将这些液体平板划线于TSA 培养基上，37℃，5%CO2培养24～48 h，连续纯化培养，挑取针尖大小，透明光滑的菌落进行镜检、生化鉴定、PCR 和测序等对致病菌进行鉴定，最终确定分离菌株是否为HPS。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料及菌种来源

试验病料来源于青岛某养猪场一份疑似HPS 感染的病猪关节液。

1.1.2 药品与试剂盒

TSA、TSB 培养基购自北京银杏林科技开发有限公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；NAD、细菌生化鉴定管、药敏纸片购自青岛海博生物技术有限公司；dNTP、PCR Buffer（Mg2+）、Taq DNA 聚合酶、DL-2000 均购自TaKaRa 生物公司。

1.1.3 主要培养基

TSA 培养基的配制：称取TSA 培养基40 g ，溶解于1 000 mL 蒸馏水中，121℃灭菌20 min，冷却至60℃左右，加入含0.005%的NAD 和5%胎牛血清，倾倒平皿至凝固，4℃保存备用。

TSB 培养基的配制：称取TSB 培养基30 g，溶解于1 000 mL 蒸馏水中，121℃灭菌20 min，冷却至60℃左右，加入0.005%的NAD 和5%胎牛血清，4℃保存备用。

1.1.4 其他缓冲液及试剂

灭菌生理盐水：称取0.9 g NaCl 溶解于100 mL 蒸馏水中，121℃灭菌15 min，4℃保存备用。

1.1.5 主要仪器设备

HZQ-FX 全温振荡器，购自哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；DXP-9082 型电热恒温培养箱，购自上海精密实验设备仪器公司；1010-2 型干燥箱，购自上海实验仪器总厂；DELTA320 电子pH 计，购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；MDF382E 超低温冰箱，购自SANYO 公司；岛津SHIMADZU 紫外可见分光光度计UV-2550，购自日本岛津公司；立式压力蒸汽灭菌器，购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；S&B FAZ14 电子天平，购自上海海康电子仪器厂；Nikon 显微镜，购自尼康仪器（上海）有限公司；SW-CJ 型超净工作台，购自济南洁净康净化设备厂。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌分离培养

从具有典型浆膜炎、腹膜炎、心包炎的病猪体内，无菌采集关节液，接种于TSA 平板，并置于37℃，5%CO2培养箱中，连续纯化培养。最后挑取单菌落，与生理盐水混匀后，进行革兰氏染色，观察分离菌株形态。

1.2.2 生化鉴定

在超净工作台中，用接种环挑取针尖大小，光滑透明的单菌落接种于TSB 液体培养基中，180 r/min 震荡培养12～16 h，吸取菌液依次加入到以下生化鉴定管中：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、氧化酶、接触酶、吲哚、硝酸盐还原、尿素酶，37℃恒温箱中培养，记录生化试验变色情况。

1.2.3 PCR 扩增反应

1.2.3.1 引物设计

上游引物：5'-GGC TTC GTC ACC CTC TGT-3'

下游引物：5'-GTG ATG AGG AAG GGT GGTGT-3'

1.2.3.2 细菌DNA 提取

菌液直接煮沸法：取经镜检无杂菌污染的HPS 菌液1 mL，于10 000 rpm/min 离心5 min，将上清倒掉，用双蒸水溶解沉淀物，100℃煮沸15 min，12 000 rpm/min 离心5 min，收集上清，-20℃保存备用。

菌落直接PCR：将HPS 菌落直接加入PCR 反应管中，预变性温度为97℃，时间7 min。

1.2.3.3 扩增基因组DNA反应体系和扩增条件如下。如表1、表2。

表1 反应体系

表2 反应条件

经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，通过凝胶成像系统观察扩增结果。

1.2.4 产物序列分析

将产物、引物直接送至华大基因进行测序分析。

1.2.5 HPS 生长曲线测定

在无菌条件下，用少量TSB 培养基洗下固体培养基上的菌苔，用移液枪吸入100 mL 的TSB 培养基中，37℃180 r/min 震荡培养，16 h 后，吸取20 μL 加入到全自动微生物生长系统反应板中，加入TSB 培养基400 μL，连续震荡培养，每隔2 h 测定600 nm 处吸光光度值，绘制HPS 生长曲线。

1.2.6 豚鼠致病性、药物敏感性分析

将15 只豚鼠随机分为3 组，分别为试验组一、试验组二、对照组，每组5 只。分别注射1 mL 1.0×108CFU/mL 的HPS、1 mL 1.0×109CFU／m LHPS 和l mL TSB，观察7 d。将死亡豚鼠进行剖检观察，作细菌分离、PCR 检测。7 天后处死剩余的豚鼠，观察豚鼠的临床病理变化，分离细菌。

选用直径90 mm 的平皿，密集划线接种菌种，无菌放置7 个药敏纸片，倒置37℃温箱培养24 h，取出测量观察结果。

2 结果与分析

2.1 菌落及形态

关节液在TSA 培养基上，经过连续分离纯化，挑取具有针尖大小，表面光滑湿润、无色透明的菌落（见图1），与生理盐水混匀涂片，进行革兰氏染色。鉴定结果为革兰氏阴性，短杆状（见图2）。

图1 菌落形态

2.2 生化鉴定结果

在超净工作台中，用接种环挑取针尖大小，光滑透明的单菌落接种于TSB 液体培养基中，180 r/min 震荡培养12～16 h，吸取菌液依次加入到生化鉴定管中，试验结果均与HPS 标准菌株的特征相符合，菌液生化鉴定结果与接触酶、硝酸盐还原试验为阳性，与氧化酶、尿素酶试验为阴性（表3）。

图2 革兰氏染色阴性（10×100）

2.3 PCR 结果

经过PCR 扩增，其产物为822 bp 大小的片段，与预扩增目的片段大小一致。电泳结果见图3 所示，1 为分离株16S rRNA 扩增结果。

图3 PCR 扩增结果

2.4 PCR 产物序列比对结果

通过与NCBI Blast 比较，该分离株序列与已发表的副猪嗜血杆菌16S rRNA 序列同源性最高，为99%，证明分离株均为副猪嗜血杆菌。

表3 HPS 生化鉴定结果

2.5 生长曲线

根据OD600测定情况，将副猪嗜血杆菌生长曲线绘制见图4。

图4 副猪嗜血杆菌生长曲线

HPS 生长曲线说明，接种后4 h 左右，菌液OD600值逐渐上升，在14 h 左右达到最大值，此后随着时间的延长，OD600值基本不变。

2.6 分离株对豚鼠致病性及药物敏感性分析

试验组一5 只豚鼠均未发生死亡，但精神萎靡；试验组二攻毒后第1 d 死亡2 只豚鼠，第2 d 死亡3 只豚鼠，剖检可以观察到肺脏有明显的出血点，但是无其他特征性的病变，可分离到HPS；对照组无任何症状。一周后解剖存活的豚鼠，结果显示，对照组无任何病变；试验组一的豚鼠肺脏有弥漫性出血点、实变、肿胀，肝脏出现肿胀和充血，但未见浆膜炎症状。

药敏试验结果显示，副猪嗜血杆菌对头孢曲松高敏感，对阿奇霉素低敏感，对其他药物敏感。具体见表4。

3 讨论

3.1 HPS 的分离

HPS 的分离一般选用濒临死亡的未用抗生素治疗的病料，死亡病料中一般很难分离。分离从具有典型病变的肝脏、肺脏、心包液、关节液等部位进行。从鼻腔、支气管等部位分离的HPS 为常在菌，与致病性无关。本研究分离的菌株在细菌形态、生化鉴定、PCR 等都符合HPS 的标准，可确定为HPS。

表4 药物敏感性试验结果

3.2 PCR 鉴定结果

采用PCR 方法鉴定副猪嗜血杆菌，可以有效区别临床症状与副猪嗜血杆菌病相似的猪传染性胸膜肺炎、支原体肺炎、猪链球菌病等。并且与传统的细菌分离和生化鉴定等方法相比较，PCR 具有准确、灵敏、快速等优点。但有研究发现，HPS 与巴氏杆菌属某些细菌有高度同源性，PCR 方法不排除会出现假阳性。因此，鉴定时还要结合细菌分离、生化鉴定等传统方法，避免假阳性的出现。

3.3 HPS 的生长曲线

本试验采用全自动微生物生长分析系统测定HPS 的生长情况，试验数据反映出HPS 连续培养中，4 h 后进入对数生长期，14 h 进入生长平台期，此时菌体数目较大。该试验结果为灭活疫苗的研制中灭活时间的选取提供了依据。但不足的是，该试验未能对HPS 在不同时期的活菌数进行测定，希望其他研究人员可以开展此项工作，对HPS 的生长特性深入了解。