不同微生物发酵豆粕的差异化研究

叶耀辉 钟鲁龙 雷松波 王金宝

（福建省宁德市农业科学研究所，福建宁德 355017）

豆粕是现代养殖中使用最普遍的蛋白质原料，同时，豆粕本身含有多种抗营养因子，如胰蛋白酶抑制剂、植酸盐等[1]，降低了畜禽对饲料的利用效率。利用微生物固态发酵的方法，可以很好地去除豆粕中的胰蛋白酶抑制因子、植酸、脂肪氧化酶等[2]，选择合适的微生物组合，也可以提高豆粕粗蛋白、小分子蛋白、多肽等的含量[3,4]，提高豆粕的营养价值。发酵豆粕一般直接在饲料中添加使用，可提高畜禽生长性能[5,6]，降低水产饲料中鱼粉使用量等[7]。发酵所用微生物菌株和发酵后干燥工艺对发酵豆粕营养价值影响很大，特别是发酵后的干燥工段大大降低了发酵豆粕的风味和适口性，且会损失部分益生菌和益生物质。近年来，随着微生物与固态发酵技术的普及，一些规模化养殖场开始在养殖现场直接进行豆粕固态简易发酵，以最大程度保留发酵豆粕的酸香风味和益生物质，主要在幼龄动物和种猪饲料中添加使用。由于养殖场技术力量有限，所选菌种一般是网购的复合菌剂，发酵条件也比较简陋，一般是将豆粕直接装在桶或者袋子中简易发酵7～15 d后直接使用，对最终发酵后的豆粕营养组分变化不清楚，导致现场制作的发酵豆粕质量层次不齐，甚至存在霉菌超标的问题，反而对动物有害。本研究选择了用于豆粕发酵的几种常用益生菌，分别对豆粕进行发酵处理，研究不同微生物在豆粕发酵过程中产生的一系列微生物和生化指标变化的差异，评估不同发酵条件下可能存在的潜在风险，为养殖场现场发酵提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

嗜酸乳杆菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心（编号：CICC6075）；酿酒酵母购于安琪酵母股份有限公司；枯草芽孢杆菌购于福建省新闽科生物科技开发有限公司。豆粕购于泉州福海粮油工业有限公司；硫酸铵为分析纯级，其他试剂均为工业级。

1.2 发酵液制备

嗜酸乳杆菌制备：葡萄糖2%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、无水乙酸钠0.5%、柠檬酸钠0.2%、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.058%、硫酸铵0.02%、吐温0.1%、水1 000 mL，pH值调至6.2～6.6之间，发酵48 h左右停止发酵，将发酵液用蒸馏水调制到菌数为109CFU/mL数量级，备用。

枯草芽孢杆菌制备：将菌粉加蒸馏水调制到菌浓度为109CFU/mL数量级，备用。

酿酒酵母制备：将安琪酵母加蒸馏水调节菌浓度到109CFU/mL数量级，备用。

1.3 基础物料配制及接种发酵

基础物料配制与接种：豆粕与水按2∶1比例，枯草芽孢杆菌菌液、嗜酸乳杆菌发酵液、酿酒酵母菌液分别按豆粕重量的10%进行接种。分别在20℃、37℃进行厌氧固态发酵，在第1 d（D1）、第3 d（D3）、第7 d（D7）、第15 d（D15）取样进行分析，测定接种微生物活菌总数、霉菌总数以及小分子蛋白等生化指标。

1.4 小分子蛋白含量测定

取1 g发酵豆粕溶于50 mL蒸馏水中，调pH值至4.5后进行沉淀，4 000 r/min离心10 min，取上清液，用Folin-酚法测定蛋白含量[8]。

1.5 垂直板状十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）

参照Laemmli方法[9]，分离胶质量浓度为125 g/L，浓缩胶质量浓度为44 g/L，电压120 V，0.1%考马斯亮蓝染色。豆粕蛋白抽提液用非还原电泳处理液进行处理。

2 结果与讨论

2.1 不同接种菌株发酵过程微生物指标变化情况

根据发酵实际条件，豆粕不经任何处理，与水按比例混合后，分别接种不同益生菌，厌氧发酵，在不同时间取样测定相应的微生物指标。

由表1可知，10%接种量接种不同益生菌，不同的温度条件下，益生菌生长情况差异很大。20℃时，3种菌株的生长均不明显，1周后，菌株数量普遍下降，说明温度较低时，豆粕发酵程度很低，达不到发酵的目的。在37℃条件下，无论芽孢类、乳酸菌类还是酵母类，均生长迅速，尤其以芽孢杆菌萌发生长最快，持续较长时间时活性菌体数仍然很高。接种乳酸菌和酵母菌1周后，有效活性菌数明显减少。若希望豆粕在发酵中能够提供有效的益生微生物，则发酵温度和发酵时间都应该控制在合适范围内。从表观性状看，芽孢杆菌类发酵豆粕颜色偏红，气味一般；乳酸菌发酵豆粕有酸香味，味道最佳；酵母菌发酵豆粕则有酒香味，时间越长，酒味越浓，不利于动物采食。

表1 接种微生物菌数变化情况

简易发酵豆粕外观看基本没有霉菌，但仍然有霉菌感染的风险，在上述条件下，霉菌总数测定结果如表2。

表2 霉菌总数变化情况

接种益生菌7 d和15 d时，表观观察未发现霉变现象。表2取样测定结果显示，1周后，接种芽孢杆菌和酵母菌豆粕中霉菌的数量均有增加，尤其是在37℃条件下，霉菌含量明显上升。15 d时，接种枯草芽孢杆菌的豆粕霉菌总数已接近霉菌的限量标准。说明在简易发酵操作实践中，虽然发酵豆粕外观看不出太大的差异性，但豆粕内部已经有不同数量的霉菌，随着发酵时间延长，必然会造成发酵豆粕霉菌毒素含量的增加，对养殖动物有一定的负面作用。从微生物指标看，养殖场现场发酵豆粕时必须严格控制发酵温度和发酵时间，尤其在夏季高温时发酵时间应控制在1周之内。

2.2 不同接种菌株发酵过程生化指标变化情况

从生产实际来看，对豆粕进行固态发酵主要是希望解决豆粕抗原的问题。豆粕中的主要抗营养因子是抗原蛋白，利用微生物对豆粕进行发酵处理，可以降解豆粕中的7S和11S球蛋白[10]，生成具有益生功能的活性小分子物质。不同微生物对豆粕固态发酵后的小分子含量差异很大，结果见表3。

表3 小分子蛋白的差异

由表3可知，芽孢类微生物固态发酵豆粕后产生的小分子蛋白最多，可达8%以上，其次是乳杆菌类发酵豆粕，最次是酿酒酵母。20℃时，从小分子蛋白含量变化情况看，豆粕发酵程度非常低，远远低于37℃条件下的发酵水平。从时间上看，在第3 d后，小分子蛋白的含量虽略有上升，但基本上变化不大，显示前3 d的豆粕发酵至关重要，此段时间，菌株处于最佳的活力状态，且在分子水平对豆粕的发酵已基本完成。

2.3 不同接种菌株发酵豆粕蛋白SDS-PAGE比较分析

不同微生物发酵豆粕7天后，分别取样抽提蛋白，经非还原电泳处理液处理后，进行SDS-PAGE分析，如图1所示。

图1 不同微生物发酵豆粕蛋白电泳图

从图1可以明显看出，37℃条件下，芽孢杆菌发酵处理后的豆粕大分子蛋白条带明显变浅，大部分被发酵处理成低于20 KDa分子量的小分子蛋白，其次是乳酸菌和酵母菌。而在20℃条件下，3种微生物发酵豆粕对大分子蛋白的酵解程度均比较低。相关研究表明，豆粕中大分子蛋白质含量与小肠绒毛高度隐窝深度呈负相关[11]，这也是发酵豆粕降低大分子蛋白含量后有利于改善幼畜肠道平衡的原因。

本研究数据显示，用不同种类的微生物对豆粕进行固态发酵处理，均可以不同程度地降低豆粕主要抗原因子7S和11S球蛋白的水平，相应地提高发酵豆粕的小分子物质含量，从而使发酵豆粕应用于仔猪时，可以降低腹泻率，提高消化酶活性，促进仔猪肠道发育，提高断奶仔猪生长性能[12]。应用于肉鸡和肉鸭则可以提高增重，改善料重比，并降低盲肠大肠杆菌数量，增加乳酸菌数量，改善肠道微环境[13,14]。乳酸菌和酵母菌类微生物可以明显提高发酵豆粕的香味和适口性，经常作为复配菌种，应用于多菌种发酵豆粕的研究中[15]。

3 结论

发酵豆粕应用效果的差异关键在于发酵微生物的选择。在养殖场简易发酵时，应根据生产实际需要，选择合适的微生物菌株或者菌株组合。芽孢类微生物发酵有助于提高小分子蛋白的含量，乳酸菌类微生物则有助于提高豆粕适口性。发酵时应注意温度与时间的控制，夏季发酵时间应不超过1周，冬季发酵时间适当延长到2周或以上。养殖场应配置简易的微生物测定工具，随时监控豆粕发酵过程的微生物变化，防止潜在的微生物安全风险。不同微生物对豆粕的酵解程度不同，发酵豆粕的利用价值差异很大。工业化制备发酵豆粕时，一般采用复合菌种进行好氧或厌氧发酵，在降低豆粕抗营养因子、提高豆粕功能性多肽含量等方面均有很好的效果。