血清样品质量对抗体检测结果的影响

吴海超 丁 飞 赵 攀

（佳和农牧股份有限公司，湖南长沙 410000）

目前很多规模猪场都建立了本场的动物疾病诊断实验室。而抗体检测方法作为一种评估猪群健康状况的手段，以灵敏、特异、简单、快速、稳定、高通量、易于操作等优点广泛应用于临床猪场生产中。相比传统的动物疾病诊断方法，抗体检测有其巨大的优势，但是对于血清样本的质量要求相对较高，因为血清样品的质量可直接影响抗体检测结果的准确性。

为调查不合格血清样品质量对抗体检测结果的影响，同时也为了确保抗体检测结果的准确性，特设计开展本试验，旨在为规范猪场送检合格的血清样品提供参考依据。

1 材料

1.1 主要仪器与设备

酶标仪，美国Thermo公司；不同量程移液器，德国Eppendorf公司；离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.2 检测试剂盒

猪瘟病毒抗体试剂盒（批号：M101）、猪蓝耳病抗体试剂盒（批号：M211）、猪伪狂病野毒抗体试剂盒（批号：EP435）购自于美国IDEXX公司，由长沙达可思生物科技有限公司提供。

1.3 样品来源

某猪场采集的新鲜血液，样品包括怀孕母猪、后备母猪、保育猪（46日龄）、育肥猪（142日龄）不同阶段猪群血清。

2 方法

2.1 样品制备

猪场采集不同阶段猪群血液各5份，共20份，将采集的每份新鲜血液制备成标准、未分离、轻度溶血和重度溶血4种血清样品状态，具体如下图（图1、图2、图3、图4）。

图1 标准血清

图2 未分离血清

图3 轻度溶血

图4 重度溶血

2.2 样品分组

根据制备的4种血清状态对其进行分组，将标准血清、未分离血清、轻度溶血和重度溶血血清分别分为A、B、C、D 4组。

2.3 抗体检测

分组之后，严格按照猪瘟、蓝耳病、伪狂犬病野毒抗体试剂盒操作说明书对4组血清样品进行检测，并保证检测时温度的稳定性和操作条件的统一。

2.4 结果分析

根据各项抗体试剂盒检测得到的OD值分别计算4组血清样品的猪瘟抗体阻断率、蓝耳病抗体S/P值和伪狂犬病野毒抗体S/N值，以A组标准血清组检测结果为参考值，分析B、C、D 3组血清质量不合格组对各项抗体检测结果的影响。

3 试验结果

3.1 各项抗体检测结果

通过同一批号猪瘟抗体检测试剂盒、蓝耳病抗体检测试剂盒、伪狂犬病野毒抗体检测试剂盒在同一室温条件下对A、B、C、D 4组血清进行了2轮抗体检测，通过对2轮重复试验检测结果进行整理，计算A、B、C、D 4组血清的猪瘟抗体平均阻断率、蓝耳病抗体S/P平均值和伪狂犬病野毒抗体S/N平均值。发现4组血清中猪瘟、蓝耳病抗体平均值均以A组标准血清组平均值最低，而伪狂犬病野毒抗体S/N值平均值以A组最高。相比A组，B、C、D 3组质量不合格血清组猪瘟抗体和蓝耳病抗体水平普遍上升，而伪狂犬病野毒抗体水平普遍下降，具体结果见表1及图5。由此得出，血清质量不合格时，容易使检测结果出现误差，导致猪瘟、蓝耳病及伪狂犬病野毒抗体假阳性结果的出现，与岳展尹[1]报道的结果一致。尤其是对于伪狂犬病野毒抗体的检测，血清样品质量是否合格影响较大。

图5 猪瘟、蓝耳病及伪狂犬病野毒抗体平均值变化

3.2 群体检测结果样本上升与下降

表1 4组血清样品猪瘟、蓝耳病、伪狂犬病野毒抗体水平平均值变化

以A组抗体检测结果为参考值，计算B、C、D 3组猪瘟抗体阻断率、蓝耳病抗体S/P值和伪狂犬病野毒抗体S/N值。通过对4组血清样品抗体检测结果进行对比分析发现，相比A组，B、C、D 3组大部分样品猪瘟抗体、蓝耳病抗体的检测结果存在上升，部分样品伪狂犬病野毒抗体检测结果存在下降。其中猪瘟抗体和蓝耳病抗体样品检测结果上升比例达到了65%以上，伪狂犬病野毒抗体样本检测结果下降比例在35%以上，具体结果见表2及图6。

表2 4组血清样品猪瘟、蓝耳病、伪狂犬病野毒抗体检测结果变化比例 （%）

4 讨论

通过3种常规疾病抗体试剂盒对标准血清和3组质量不合格血清样品进行检测，分析其结果发现：血清样本质量不合格会对抗体检测结果造成影响，导致猪瘟抗体阻断率、蓝耳病抗体S/P值的升高和伪狂犬病野毒抗体S/N值的降低，通过升高或降低样品的检测值从而对整个群体的抗体水平造成影响，特别是检测结果在判定值边界的样品，如猪瘟抗体阻断率在90%和30%～40%的样品，容易导致猪瘟抗体超阳性率和阳性率的升高，蓝耳病抗体S/P值在2.5和0.4左右的样品，同样引起蓝耳病抗体超阳性率和阳性率的升高。对于伪狂犬病野毒抗体的检测，判定值在0.6和0.7左右时，容易导致伪狂犬野毒假阳性结果的出现，从而造成对整个结果的误判。因此保证血清样品的质量在抗体检测中显得尤为重要。

血清样品的质量常受因红细胞破裂发生溶血、室温或冷藏放置时间过长和样品反复冻融等因素的影响。血清样品溶血主要由于红细胞破裂导致细胞内容物中的水、血红蛋白（Hb）、无机盐等物质的释放，血红蛋白中的亚铁血红素具有类似辣根过氧化物酶的作用，当血红蛋白及其他非特异性物质吸附至反应孔孔壁，与包被的抗原非特异性结合，在洗涤液未洗干净时，催化底物出现显色反应；还有细胞内释放的一些其他内容物与包被物结合，导致血清中抗体与包被的抗原反应减少，从而减弱显色反应[2]。因此样品发生不同程度的溶血后均会影响抗体检测结果的准确性。同时样品在室温或者冷藏环境中放置时间过长和样品在-20℃反复冻融都会引起血清中抗原抗体的降解，也会对检测结果造成一定的影响。因此在进行抗体检测时，保证血清样品的质量很关键。

图6 4组血清样品猪瘟、蓝耳病、伪狂犬病野毒抗体检测结果上升比例

由于本次试验选择的质量不合格血清样品是由猪场采集的新鲜血液制备而成，因此样品选择随机性很大，各项抗体检测在判定值边界的样品较少，且检测伪狂犬野毒抗体的血清样品也全部呈伪狂犬野毒阴性，因此在样品选择上存在一定的瑕疵。但是通过本文得出的结论还是可以明显看出血清质量不合格对抗体检测的影响，希望通过本研究得出的相关结果能为猪场规范送样流程提供借鉴。