饲料及原料中霉菌毒素的免疫层析快速检测技术

张文静 吴雨豪 熊勇华

（食品科学与技术国家重点实验室/南昌大学，江西南昌330047）

质量安全

饲料及原料中霉菌毒素的免疫层析快速检测技术

张文静 吴雨豪 熊勇华*

（食品科学与技术国家重点实验室/南昌大学，江西南昌330047）

霉菌污染在饲料及原料中广泛存在，不仅造成直接采食的动物急性或慢性中毒，而且在动物产品中会有一定残留，进而对人体产生危害。建立饲料及原料中霉菌毒素的高灵敏快速检测技术对有效控制霉菌毒素的危害具有重要意义。免疫层析试纸条是利用层析技术和抗原抗体特异性免疫反应原理建立的一种检测技术，具有快速简单、低成本、无需大型仪器辅助及可裸眼观察等特点，特别适合于大量样本中霉菌毒素的现场快速筛查检测。本文对基于不同标记物的免疫层析技术在霉菌毒素检测中的应用进行简要介绍。

霉菌毒素；免疫层析试纸条；胶体金；荧光微球

真菌毒素，是真菌在适宜的温度、湿度和基质中产生的具有生物活性的次级代谢产物，这类毒素主要污染粮食和饲料，因此在粮食及饲料卫生学领域又称霉菌毒素[1]。目前已知的霉菌毒素有300多种，其中分布范围较广、毒性危害较大的主要有黄曲霉毒素（aflatoxin, AF）、玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEN）、脱氧雪腐镰刀烯醇（deoxynivalenol,DON）、赭曲霉毒素（ochratoxin,OT）、伏马菌素（fumonisins）及T2毒素等。据联合国粮食及农业组织（FAO）估算，全世界每年约有25%的谷物受真菌毒素污染，约2%的农产品因霉变而失去营养和经济价值，其中受黄曲霉毒素的污染最为严重，给畜牧业带来严重的经济损失[2]。

被霉菌污染的饲料和谷物颜色、气味发生改变，脂肪迅速变质，导致饲料的适口性变差，因而动物的采食量下降，日增重明显降低，生长缓慢；对处于特定生理阶段的动物，部分霉菌毒素会引起多方面的繁殖功能紊乱，造成繁殖性能降低；同时，霉菌毒素降低T淋巴细胞和B淋巴细胞的活性，抑制免疫球蛋白和抗体的产生，导致免疫抑制；霉菌毒素可抑制动物体内蛋白质和酶的合成，破坏细胞结构，损害动物的肝脏、肾脏、神经等器官和组织[3-6]。霉菌毒素在动物产品中会有一定的残留，其中黄曲霉毒素和赭曲霉毒素A代谢较慢，通过食物链对人体产生危害。因此，早期监控饲料及原料中的霉菌毒素是防治霉菌毒素对畜牧业危害、减少经济损失、保障消费者身体健康的最为有效的措施之一。我国《饲料卫生标准》（GB 13078-2001）对饲料及原料中各霉菌毒素的最大允许量作了严格的限制。

针对霉菌毒素的现有检测方法主要有薄层色谱法（TLC）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱-质谱联用法（HPLCMS）、近红外光谱法（NIR）、酶联免疫吸附法（ELISA）以及免疫层析法（ICA）等[7]。仪器分析法因其灵敏度高、结果准确可靠而受到检测机构的青睐，并作为真菌毒素的常用确证检测方法；但仪器分析法需要昂贵的精密设备，专业的实验操作人员，且存在检测成本高、样品前处理复杂、操作步骤繁琐等缺陷，无法满足基层单位批量样品的快速筛查检测。

为了有效地防控饲料及原料中霉菌毒素的污染，需要建立适合基层单位使用的、可现场操作的快速分析方法。免疫层析方法是建立在免疫标记及层析技术基础上的一项快速检测技术，具有检测时间短（约5～10分钟）、操作简单、成本低、无需大型仪器辅助等特点，特别适于大量样本中真菌毒素的现场快速筛查检测。本文针对不同标记材料的免疫层析技术在霉菌毒素检测中的应用现状进行一个简要的综述。

1 不同标记物的免疫层析技术

免疫层析试纸条主要由样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜（NC膜）、吸水垫及黏性底板等几个部分组成。试纸条上NC膜固定有测试线和质控线；样品溶液加入至样本垫，喷涂在结合垫上的抗体标记物在样品溶液带动下通过毛细管作用使待测物在层析试纸条上移动，经过检测线时发生特异性免疫反应，游离的抗体标记物进一步与质控线发生免疫反应；检测结果通过分析测试线的显色深浅或吸光度大小进行定性或半定量判定。免疫层析试纸条标记材料依据光谱特性的不同可分为两类：一类是吸收光谱型材料，包括胶体金、胶体碳、磁珠等；另一类是发射光谱型材料，包括量子点及量子点微球、荧光微球以及上转换磷光纳米粒子等。

1.1 吸收光谱型标记材料

1.1.1 胶体金纳米粒子

胶体金是氯金酸（HAuCl4）在还原剂如柠檬酸三钠、硼氢化钠、对苯二酚等作用下，还原生成一定大小的金纳米粒子，该纳米粒子由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。胶体金表面带负电，可与蛋白质分子的正电荷基团或巯基通过静电吸附以及金硫键结合在一起，形成胶体金标记物。基于胶体金为标记材料的免疫层析法是目前应用最广泛的一种试纸条产品，并大量应用于AFB1[8-9]、OTA[10-11]、ZEN[12]以及DON[13]等毒素的快速检测。

试纸条检测灵敏度不仅与标记抗体的灵敏度有关，同时与胶体金纳米粒子的大小以及形貌密切相关。例如，Li等[10]以不同粒径的球状胶体金为标记物探究胶体金粒径大小对免疫层析试纸条检测灵敏度的影响，发现粒径为20 nm的胶体金因摩尔消光系数较小而呈色浅，导致试纸条检测灵敏度偏低；以粒径为100 nm的金纳米粒子为标记探针，由于该探针具有高的吸光强度，应用于OTA的检测显示出最高检测灵敏度；而180 nm大粒径的胶体金由于具有较强的空间位阻效应，检测灵敏度偏低。Xu等[11]进一步探究了金纳米粒子形貌对免疫层析试纸条检测性能的影响，分别制备了粒径相同的无刺突球状胶体金、短刺突多枝状（刺突长度为7～8 nm）胶体金、长刺突多枝状（刺突长度为13～15 nm）胶体金，并以三种不同形貌胶体金为标记材料制备免疫层析试纸条，结果发现以长刺突多枝状胶体金为标记材料应用于OTA的检测灵敏度最高，且单张试纸条抗体使用量最少。

为了能够进一步提高胶体金免疫层析试纸条的检测灵敏度，部分研究人员[14]将胶体金与拉曼信号分子联用，建立了新型的表面增强拉曼散射-免疫层析联用试纸条检测方法（SERS-ICA），并成功地应用于盐酸克伦特罗（俗称“瘦肉精”）的检测，最低检测限达到了0.06 pg/m L。同时Tang等[15]以氨基化的磁珠为核，制备了金纳米层为壳的金磁复合物微球，并应用于食品中AFB2的检测，最低检测限达到0.9 ng/m L，灵敏度较传统胶体金试纸条有所提高。

1.1.2 磁珠纳米探针

磁珠免疫层析技术是将磁性纳米材料的磁信号与免疫层析技术相结合的技术。磁纳米探针通常由磁性元素（如Fe、Ni、Co）和它们的氧化物组成，该探针具有比表面积大、超顺磁性、生物相容性、单分散性良好及可快速移动等特性，是信号收集和免疫反应的良好载体。磁珠表面通过修饰功能基团，可偶联抗体等活性蛋白物质，抗体与特异性抗原结合形成磁珠-抗原-抗体复合物，在外加磁场的作用下，可以快速定向移动，使复合物从液体中分离出来，从而达到聚集、分离、纯化等目的。

Huang等[16]以黄曲霉毒素M1抗体标记的磁性纳米粒子为探针，与待检样本混合捕获、磁分离，浓缩悬浮液直接用免疫层析试纸条检测。该方法集样本的浓缩富集与免疫层析于一体，对原料乳中AFM1的检测限达到了0.1 ng/m L，低于国家制定的AFM1限量标准。Wang等[17]探究了磁性物质含量及磁珠粒径对免疫层析试纸条检测性能的影响。试验结果显示，磁珠粒径主要决定磁珠在NC膜上的流动速率，从而影响试纸条的判读时间；而T线信号强度则与磁珠中磁性物质的含量密切相关。为了获得更佳的检测性能，建议选择粒径小而磁性物质含量相对较高的磁珠为标记材料。

1.2 发射光谱型标记材料

1.2.1 量子点及量子点微球

量子点又称无机半导体纳米晶体，是一类由ⅡB-ⅥB族（如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等）或ⅢB-ⅤB族（如InP、InAs等）元素组成的纳米颗粒。量子点的粒径一般介于1～10 nm之间，外观似点状，故称为量子点。量子点有很强的尺寸效应，一定范围内，其发射光的波长与量子点粒径正相关；且量子点激发光谱宽，发射光谱狭窄而对称，单色性好，重叠小。此外，量子点材料的量子产率高，经一系列化学修饰后的量子点具有稳定的水溶特性、良好的生物相容性、光化学稳定性和更低的细胞毒性，可以很好地应用于荧光标记。如李文君[18]以巯基丙酸修饰的Cd Te量子点为标记探针，建立了一种检测OTA的荧光免疫试纸条，定量检测OTA的最低检测限可达到5 ng/m L。

相比常规量子点，量子点微球包埋了大量的量子点，因而具有更强的荧光信号以及光学稳定性。如Ren等[19]以聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚马来酸酐十八醇酯（PMAO）以及油溶性Cd Te/ZnS量子点为材料，采用微乳液法制备了粒径为255 nm的量子点微球。在同等摩尔数下，量子点微球的荧光强度是量子点的2863倍。以该微球为标记材料建立检测AFB1免疫荧光试纸条，定量检测AFB1的线性范围为5～60 pg/m L，灵敏度较常规量子点免疫荧光试纸条提高了39倍。该课题组[20]进一步采用量子点微球为标记探针，建立了检测ZEN的荧光免疫层析方法，该方法检测标准溶液中ZEN的最低检测限达到62.5 pg/m L，检测实际玉米样品中ZEN的检测限为3.6 μg/kg（样品稀释倍数为30倍）。

1.2.2 荧光微球

荧光微球是一种以高聚物为介质且包埋大量荧光分子的微粒材料，粒径范围一般为纳米至微米级（0.01～10 μm），在外界特定波长范围的激发光照射下能发出荧光。制备荧光微球时，一般是将荧光物质通过物理吸附法、自组装法、包埋法、化学键合法以及共聚法等方式引入纳米粒子中，由高聚物作为外壳包裹，因此形态结构稳定，掺杂的荧光物质不易受到外界环境的干扰，光稳定性好，不易被光降解或漂白；微球内部包含着几万至几百万个荧光物质单体，因此发光强度大。荧光微球按内部包被的荧光单体材料不同，可分为荧光染料掺杂的微球以及时间分辨荧光微球等。如Huang等[21]将钌Ⅱ-邻菲咯啉包被在硅球中，获得的微球荧光强度是同等摩尔数钌Ⅱ-邻菲咯啉的23000倍。时间分辨荧光微球是指微球中包埋了Eu3+、Tb3+、Sm3+等三价稀土元素及其螯合物，具有良好的水溶性和生物兼容性，且其荧光衰变时间长，可在待测样品中自然荧光衰变后再检测稀土离子的荧光，这样可有效排除自然荧光的干扰，因而具有灵敏度高、特异性强、稳定性好以及无放射性污染等优点。例如，张兆威等[22]将Eu3+包覆于乳胶颗粒中，并应用于时间分辨免疫层析试纸条。通过将抗AFB1抗体与微球偶联标记，建立了检测AFB1的时间分辨荧光免疫层析快速检测技术。该方法对花生、稻米、植物油等农产品的检测限均为0.3 μg/kg。李静等[23]亦研制了检测AFB1的时间分辨免疫层析试纸条及相应的读取装置，检测油料饼粕中AFB1结果与液相色谱质谱联用法结果有良好的一致性。

1.2.3 上转换磷光纳米粒子

上转换磷光纳米粒子是将稀土元素掺杂于惰性氧化物中获得的新型发光纳米材料。上转换磷光纳米粒子能够在能量较低的长波辐射激发下，发射出能量较高的短波辐射，因而应用于免疫层析试纸条时无自发荧光和本底荧光的干扰，但该类纳米粒子水溶性和分散性较差，需要通过表面修饰提高纳米粒子在溶液中的单分散性。如吴世嘉[24]采用水/溶剂热法制备上转换磷光纳米粒子，通过包覆二氧化硅形成核壳结构并进一步建立了基于适配体识别的上转换磷光标记检测OTA的免疫层析方法。於然等[25]制备了表面羧基修饰的核壳结构上转换磷光纳米粒子，并应用于DON的快速检测，该试纸条的最低检测限达到了0.7 ng/m L。

2 小结

免疫层析试纸条因操作简便、检测速度快、成本低廉、无需大型仪器等特点，在大量样品的快速筛查方面具有极大的优势和广阔的应用前景，已广泛应用于饲料及原料中霉菌毒素的快速检测，但对于传统胶体金的免疫层析技术，其灵敏度仍需进一步提高。各种新型标记材料的先进应用可有效地提高免疫层析方法的检测灵敏度，尤其是基于读取仪判读结果的各类荧光免疫层析技术进一步拓展了试纸条的应用范围。另外，霉菌毒素在饲料及原料中通常多种共存，建立对毒素的多重检测不仅可节约成本，同时可提高检测效率，因此基于免疫层析平台的多重检测技术必将成为今后的发展方向之一。

[1]张艺兵,鲍蕾,褚庆华.农产品中真菌毒素的监测分析[M].北京:化学工业出版社,2006:51-78.

[2]Schatzmayr G,Zehner F,Taubel M,et al.Microbiologicals for deactivating mycotoxins[J].Molecular Nutrition＆Food Research,2006,50:543-551.

[3]房祥军,邹晓庭.饲料霉菌毒素污染的危害及其防治[J].中国饲料,2006(11):34-37.

[4]谢晓鹏,易卫,庄智明,等.饲料中的霉菌毒素及其防制措施[J].中国畜牧兽医,2013,40(5):101-106.

[5]黄海青,徐来仁,刘雯霞.霉菌毒素对养猪业的危害及防治措施[J].中国畜牧兽医,2005,32(7):62-67.

[6]王春梅,王庆林.饲料中霉菌毒素对猪的危害与控制[J].饲料博览,2010(2):36-38.

[7]张思思,陆继伟,王少敏,等.国内外真菌毒素检测方法研究现状及进展[J].食品安全质量检测学报,2016,7(7):2575-2586.

[8]邓省亮,赖卫华,许杨.胶体金免疫层析法快速检测黄曲霉毒素B1的研究[J].食品科学,2007,28(2):232-236.

[9]王督,张文,李培武,等.胶体金免疫层析法快速定量分析粮油农产品中黄曲霉毒素B1[J].中国油料作物学报,2014,36(4): 529-532.

[10]Li J,Duan H,Xu P,et al.Effect of different-sized spherical gold nanoparticles grown layer by layer on the sensitivity of immunochromatog raphic assay[J].RSC advances,2016,6: 26178-26185.

[11]Xu P,Li J,Huang XL,et al.Effect of the tipleng th of multi-b ranched AuNFs on the detection performance of immunochromatog raphic assays[J].Analytical Methods,2016,16: 3316-3324.

[12]熊齐荣,金涌,邢仕歌,等.胶体金试纸条法快速筛查小麦和玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的研究[J].食品科技,2014,39(2): 292-296.

[13]李萌,冯才伟,贾芳芳,等.一种快速检测呕吐毒素的胶体金试纸条[J].中国酿造,2013,32(11):91-93.

[14]常化仿.表面增强拉曼光谱结合胶休命免疫层析技术(SERS-ICA)的研究和应用[D].苏州:苏州大学,2013.

[15]Tang D,Sauceda JC,Lin Z,et al.Magnetic nanogold microspheres-based lateral-flow immunodipstick for rap id detection of aflatoxin B2 in food[J].Biosensors and Bioelectronics, 2009,25:514-518.

[16]Huang YM,Liu DF,Lai WH,et al.Rap id Detection of Aflatoxin M1by Immunochromatography Combined with Enrichment Based on Immunomagnetic Nanobead[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,2014,42:654-659.

[17]Wang YY,Xu H,Wei M,et al.Study of superparamagnetic nanoparticles as labels in the quantitative lateral flow immunoassay[J].Materials Science and Engineering C,2009,29: 714-718.

[18]李文君.霉菌毒素的量子点荧光免疫分析技术[D].洛阳:河南科技大学,2013.

[19]Ren ML,Xu HY,Huang XL,et al.Immunochromatographic Assay for Ultrasensitive Detection of Aflatoxin B1 in Maize by Highly Luminescent Quantum Dot Beads[J].ACS App lied Materials&Interfaces.2014,6:14215-14222.

[20]Duan H,Chen XL,Xu W,et al.Quantum-DoT submicrobead-based immunochromatographic assay for quantitative and sensitive detection of zearalenone[J].Talanta,2015,132: 126-131.

[21]Huang XL,Zoraida PA,Li HM,et al.Fluorescent Ru (phen)32+-Doped Silica Nanoparticles-Based ICTS Sensor for Quantitative Detection of Enrofloxacin Residues in Chicken Meat [J].Analytical Chemistry,2013,85:5120-5128.

[22]张兆威,李培武,张奇,等.农产品中黄曲霉毒素的时间分辨荧光免疫层析快速检测技术研究[J].中国农业科学,2014,47(18): 3668-3674.

[23]李静,李培武,张奇,等.时间分辨荧光免疫层析试纸条在油料饼粕黄曲霉毒素B1检测中的应用[J].中国油料作物学报, 2014,36(2):256-262.

[24]吴世嘉.基于上转换荧光纳米探针的高灵敏微生物毒素检测方法研究[D].无锡:江南大学,2013.

[25]於然,马雪梅,谢飞.基于上转换免疫层析技术的真菌毒素检测[J].北京工业大学学报,2015,41(12):1915-1920.

S816.2

A

1673-4645(2017)09-0074-04

2017-07-25

国家重点基础研究发展计划（973计划）课题“储粮真菌毒素早期监测预警基础（2013CB127804）”

张文静（1994-），女，四川绵阳人，硕士研究生

*通讯作者：熊勇华（1970-），男，江西南昌人，研究员，研究方向为食品质量与安全控制，E-mail：yhxiongchen@163.com