MSTN 基因敲除促进牛骨骼肌脂肪代谢

盛辉，郭益文，张林林，李新，丁向彬，郭宏

（天津农学院 动物科学与动物医学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300392）

肌肉生长抑制素Myoststin（MSTN），简称肌抑素（Growth differentiation factor-8，GDF-8），属于转化生长因子β（Transforming growth factor，TGF-β）超家族成员[1-2]。MSTN表达降低或部分、完全缺失会促进骨骼肌发育，其过表达会阻碍机体骨骼肌生长[3-4]。人们构建的敲除MSTN基因小鼠[5]、大鼠[6]、狗[7]、兔[8]和猪[9]的动物机体都出现双肌现象（Double muscle phenomenon，DMP）。同时，研究表明，MSTN在脂肪形成过程中起关键作用[10]。

脂肪作为生物三大营养素之一，是用来储存体内多余能量、调节热量代谢的。哺乳动物体内脂肪组织因脂肪细胞来源、细胞数量、细胞组成和功能等不同，可分为白色脂肪和棕色脂肪[11]。白色脂肪是储能组织，以合成和储存三酰甘油的形式储存能量，在食物缺乏的情况下将储存的能量分解供能[12]。体内白色脂肪堆积过多可引起肥胖等相关性疾病。而棕色脂肪是耗能组织，参与非寒战性产热和食物诱导性产热以抵抗低温和肥胖，二者共同维持机体能量代谢平衡。

本研究基于MSTN-/-鲁西黄牛与野生型鲁西黄牛、MSTN-/-蒙古牛与野生型蒙古牛和MSTN-/-蒙古黑牛与野生型蒙古黑牛腿臀肌肌肉组织高通量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学结果，通过生物信息学分析和组织甘油三酯测定，探究MSTN对骨骼肌脂肪代谢的影响，为深入解析MSTN对骨骼肌脂肪代谢的调控机制研究补充新的基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

本研究所用的试验动物为3 头MSTN-/-蒙古牛、3 头野生蒙古牛、3 头MSTN-/-鲁西黄牛、3头野生型鲁西黄牛、3 头MSTN-/-蒙古黑牛和3 头野生型蒙古黑牛。这18 头牛均饲喂于内蒙古大学转基因试验中心农场，饲喂条件一致。利用活体采样的方法采集试验动物的腿臀肌组织，PBS 清洗，放入冻存管中，做好标记，放入液氮中保存。

1.1.2 主要试剂

PMSF（北京索莱宝生物科技有限公司）、磷酸酶抑制剂（北京索莱宝生物科技有限公司）、RIPA（北京索莱宝生物科技有限公司）、组织细胞甘油三酯酶法测定试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）、PBS 溶液（北京索莱宝生物科技有限公司）、BCA 试剂盒（北京康为公司）、TMT-6 plex标记试剂盒和缓冲液（Applied Biosystems）。

1.1.3 主要仪器设备

低温冷冻干燥机（Thermo Fisher）、色谱分离系统（Agilent）、高效液相色谱（Applied Biosystems ）、串联质谱分析仪（Applied Biosystems）、强阳离子交换柱（Zorbax Bio-SCX）、脱盐柱（Michrom Bioresources）、C18AQ 反相分离柱（Michrom Bioresources）、HPLC 系统（Agilent）、酶标仪（Thermo Fisher）、恒温培养箱（Thermo Fisher）。

1.2 方法

1.2.1 蛋白质提取

从液氮中取出冻存的样品组织，用研钵磨成粉末状，移入新的1.5 mL 无酶离心管中，加入配制好的蛋白裂解液（1 mL RIPA，10 μL PMSF，10 μL磷酸酶抑制剂），冰浴10 min，4 ℃ 12 000 g 离心10 min，取上清保存于-80 ℃ 24 h，随后冻干成粉末状保存。

1.2.2 TMT 标记蛋白样

冻干蛋白样用磷酸盐缓冲液重溶后，加入2%SDS 溶液变性，用三（2-羰基乙基）磷盐酸盐TCEP还原，用甲基硫代磺酸甲酯（MMTS）封闭半胱氨酸残基，用胰蛋白酶37 ℃消化过夜。使用TMT-6 plex 试剂标记消化了的肽段，并对其进行脱盐处理，样品真空干燥。

1.2.3 强阳离子柱分离肽段

将TMT 6-plex 标记的胰蛋白酶肽样品混匀上样，在214 nm 波长下以1 min 间隔收集混合成若干组分，从每个组分中取出10%用于后续LCMS/MS 分析。

1.2.4 LC-MS/MS 分析

使用PepMap C-18 反向纳米柱完成肽段吸附、除盐和分离过程，并使用Analyst 1.6 软件（Sciex）进行数据采集。

1.2.5 生物信息学统计与分析

利用在线网站及软件对数据结果统计和分析，以便了解MSTN的生物学意义。Perseus 1.5.3.2软件用于对蛋白质组学数据进行分析，筛选出差异蛋白和磷酸化蛋白。DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）用于蛋白登录号转换和差异蛋白GO注释和 KEGG 途径分析。KEGG 数据库（https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）用于差异蛋白富集信号通路分析。STRING 11.0 数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl）可用于蛋白间互作分析。UniProt 数据库（http://www.uniprot.org/）用于检索蛋白的功能以及蛋白质名称转换。

1.2.6 肌肉组织中甘油三酯测定

利用试剂盒检测样品组织中甘油三酯含量。从液氮中取出保存的肌肉组织，对其精确称重，用研钵将组织磨成粉末，按每1 mg 组织加入20 μL裂解液的比例加入裂解液，涡旋震荡，室温静置10 min。取适量上清转移至新的1.5 mL 离心管中，室温2 000 r/min 离心5 min，上清液即可用于酶学测定，剩余组织裂解液用BCA 蛋白定量试剂盒测定组织蛋白浓度。配制好工作液及稀释标准品，在酶标板中加入待测样品，37 ℃反应15 min，将结果绘制标准曲线并计算甘油三酯浓度，最后以每mg 蛋白浓度校正组织中甘油三酯含量。

2 结果与分析

2.1 蛋白质组学分析结果

通过Perseus 1.5.3.2 软件分析以及UniProt 数据库检索蛋白质功能，发现蛋白质组学数据结果中大量差异蛋白与脂肪代谢过程相关，详细信息见表1、表2 和表3。

表1 MSTN-/-蒙古牛与野生蒙古牛数据中与脂肪代谢相关差异蛋白

表2 MSTN-/-鲁西黄牛与野生鲁西黄牛数据中与脂肪代谢相关差异蛋白

表3 MSTN-/-蒙古黑牛与野生蒙古黑牛数据中与脂肪代谢相关差异蛋白

2.2 KEGG 通路和STRING 蛋白互作分析

将这些差异蛋白输入DAVID 6.8、KEGG 数据库，发现这些差异蛋白主要富集在脂肪酸代谢和PPAR 信号通路上，结果见图1。并将三组数据中与脂肪代谢相关的蛋白输入STRING 数据库，分析蛋白间互作，结果见图2。

图1 差异蛋白富集脂肪酸代谢通路图

图2 差异蛋白PPI 分析结果

2.3 组织甘油三酯测定结果

用试剂盒检测组织中甘油三酯含量，并以每mg 蛋白浓度校正甘油三酯含量。结果见图3，与各个品种野生牛相比，MSTN-/-蒙古牛肌肉组织中甘油三酯含量无明显差异，MSTN-/-鲁西黄牛肌肉组织中甘油三酯含量极显著下降，MSTN-/-蒙古黑牛肌肉组织中甘油三酯含量显著下降。

图3 肌肉组织中甘油三酯含量检测结果

3 讨论

脂肪组织不仅是机体的能量储存库，还可能作为最大的内分泌器官，通过分泌多种因子调节代谢稳态、食欲、免疫等多种生物过程[13]。多项研究表明，肌肉生长抑制素MSTN在脂肪形成过程中起关键作用[10]。敲除MSTN基因的动物肌肉组织中脂肪膜转运蛋白水平（FAT/CD36，FABP3，FATP1 和FATP4）降低，这与脂质氧化途径（柠檬酸合酶和β-HAD 活性）降低相关，同时脂肪形成受损（甘油三酯和游离脂肪酸含量降低）[14]。敲除MSTN的饲喂高脂饮食（HFD）的小鼠组织脂肪酸氧化增强，产热增加，最终导致脂肪利用增加和脂肪组织减少，从而防止饮食诱发的肥胖[15]。小鼠敲除MSTN基因后显著影响了肌肉组织细胞中线粒体的功能，增强了线粒体中脂肪酸的β氧化，抑制了三羧酸循环和氧化磷酸化过程[16]。并且本实验室前期通过定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学研究发现，MSTN基因敲除能够促进脂肪酸在线粒体中的β氧化过程，加强糖酵解过程，进而促进了糖原分解[17-18]。

本研究通过对MSTN-/-牛与野生牛腿臀肌肌肉组织蛋白质组学与磷酸化组学分析以及对肌肉组织甘油三酯检测发现，敲除MSTN基因脂肪酸代谢增强，肌肉组织中甘油三酯含量降低。本研究结果与前述敲除MSTN基因小鼠脂肪酸β氧化增强、脂肪组织减少的结果相一致。

4 结论

综上所述，本研究利用敲除MSTN的蒙古牛、鲁西黄牛和蒙古黑牛与野生的蒙古牛、鲁西黄牛和蒙古黑牛腿臀肌肌肉组织作为试验样品，通过蛋白质组学与磷酸化组学分析，发现大量差异蛋白富集在脂肪酸代谢信号通路，同时对肌肉组织进行甘油三酯含量检测发现，敲除MSTN基因牛骨骼肌中甘油三酯含量降低。研究结果为接下来进一步探讨MSTN对牛骨骼肌代谢机制的相关研究提供一定参考。