一种简便的机械法分离绵羊睾丸间质细胞的研究

黄 洋，靳 辉，曹 霞，李鹏飞，姜晓龙，陈建伟，姚晓磊，赵妙妙，吕丽华

(山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷030801)

睾丸间质细胞(Leydig cell) 分布于睾丸曲精细管之间的间隙内，是一类含量很少的细胞，约占睾丸内总细胞数的2% ～4%［1］。睾丸间质细胞最重要的功能是分泌睾酮，其睾酮分泌受下丘脑-垂体-睾丸性腺轴的调节，睾丸间质细胞分泌的睾酮占动物体内总量的95%左右［2］。因为睾酮与靶器官受体结合后会发挥重要生理功能［3］，所以睾丸间质细胞作为分泌睾酮最主要的细胞，其分离培养受到人们的重视。

根据国内外文献报道，睾丸间质细胞的分离主要用酶消化法。此法先用胰酶与胶原酶消化睾丸组织后，再用Percoll 进行连续密度梯度离心或用尼龙网过滤分离［4～8］。但是此方法费时费力，整个操作流程费时近2 h，造成间质细胞死亡率上升。因此，本文将探讨一种更为省时的方法来分离绵羊睾丸间质细胞。

1 材料与方法

1.1 试验动物及睾丸样品

睾丸样品取自于当地屠宰场屠宰的成年雄性绵羊。

1.2 主要试剂

脱氢表雄酮(DHEA) 、尼克酰胺、DMSO、台盼蓝等购于Sigma 公司; 硝基蓝四氮唑(NBT) 购于Amresco 公司; 烟碱腺苷二核苷酸(NAD) 购于Roche 公司; DMEM、FBS、双抗购于Gibco 公司。

1.3 绵羊睾丸间质细胞的分离

将采集到的绵羊睾丸放入4 ℃PBS 缓冲液内，2 h 内带回实验室。先用无菌PBS 将睾丸表面冲洗干净，然后将睾丸放入75%酒精内30 s 进行消毒。将睾丸被膜用剪刀剪开，用镊子将睾丸被膜撕去。用手术刀将睾丸切成2 cm3左右的小块，将睾丸小块放入预先装有无菌PBS 的50 mL 离心管内，放在摇床上震荡20 min，使得睾丸内曲精细管组织松散开，间质细胞脱落。震荡完成后，将离心管静置5 min。此时容器内物质分层，上层为富含间质细胞的悬液，下层为睾丸曲精细管组织。取出上清液，1000 r/min 离心5 min。离心后去除上清，用含1% 双抗、10% FBS 的DMEM 培养液重悬细胞。将重悬的细胞接种入培养瓶内，32 ℃培养3 h。3 h后将未贴壁的细胞倒掉，剩余细胞接种于96 孔细胞培养板内继续培养48 h，以供间质细胞纯度鉴定。

1.4 绵羊睾丸间质细胞的活率及纯度鉴定

细胞活率鉴定采用台盼蓝染色法。将上一步分离的细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液体积比1∶1 混合，常温孵育约2 min 后，将细胞悬液涂抹于血细胞计数板上进行镜检。活细胞不着色，死细胞呈蓝色。

间质细胞纯度鉴定采用3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD) 染色法。染色液的配制方法为: 将DHEA 与NBT 共同溶于DMSO 中，两者终浓度皆为10 mg/mL，记为A 液; 将NAD 溶于 PBS 缓冲液中，终浓度为10 mg/mL，记为B 液; 将尼克酰胺溶于PBS中，终浓度为1 mg/mL，记为C 液。使用时将10 μL A 液、100 μL B 液、100 μL C 液与790 μL PBS 缓冲液配制为1 mL 新鲜的染色液。

在96 孔板内培养48 h 后的细胞，弃去培养液，每孔加入100 μL 的新鲜染色液，32 ℃继续培养1 h 后镜检。呈蓝黑色的细胞为间质细胞。

2 结果

2.1 绵羊间质细胞的活率

经台盼蓝染色后镜检观察，约40 %的细胞死亡，显示为蓝色。细胞活率约为60%。如图1 所示。

2.2 绵羊间质细胞的纯度

图1 台盼蓝染色鉴定细胞活率100 ×

经3β- HSD 染色剂对细胞染色后，视野下几乎所有细胞都呈蓝黑色，纯度高达90%以上。如图2 所示。

图2 间质细胞纯度鉴定(100 ×)

3 讨论

绵羊睾丸间质细胞的分离纯化在雄性绵羊生殖研究中非常重要，一种简便快捷且纯度高的分离方法将大大提高科研人员的工作效率。传统上分离间质细胞较为复杂，需要酶消化和密度梯度离心。酶消化与密度梯度离心都是较为耗时的工作，使得间质细胞的死亡率大幅上升。但是我们觉得间质细胞在睾丸中较为松散，不需要酶消化。

另外，间质细胞主要存在于曲精细管之间的间隙内，在保证曲精细管大致完整的情况下，曲精细管内的细胞是不会与间质细胞混合的。因此本试验根据经验省去了酶消化与密度梯度离心的步骤。结果正如我们所预料的那样，睾丸间质细胞的纯度很高，能达到90%以上。但是本试验分离的细胞活率只有60%左右，这应该是由于采样地点离实验室太远所致。从采集睾丸到运至实验室花费了近2 h。如果能把运输时间降下来，也许活率会大幅提升。这一点在将来还需要继续研究。

［1］刘建中，郭海彬，邓春华，等.大鼠睾丸Leydig 细胞的培养和鉴定［J］.中华男科学杂志，2006，12(1) : 14-18.

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［3］Yang J Y，Zhang Y F，Wang Y Q，et al.Toxic effects of zearalenone and alpha-zearalenol on the regulation of steroidogenesis and testosterone production in mouse leydig cells ［J］.Toxicol Vitro，2007，21(4): 558-565.

［4］应锋，龚昳，孙佳音，等.大鼠睾丸间质细胞的原代培养、鉴定与功能监测［J］.中华男科学杂志，2008，1(14) : 7-10.

［5］吴婷，张炜，睦元庚.体外培养的人睾丸间质细胞对绒毛膜促性腺激素刺激的反应［J］.南京医科大学学报，2003，2: 132-133.

［6］West A P，Rose M P，Cook B A.Induction of lutropin receptors by lutropin and cyclic AMP in cultured mouse tumour(MA10) leydig cells ［J］.Biochem J，1990，2: 499-503.

［7］柳海燕，王大勇，时姗姗，等.GnRH 类似物对大鼠睾丸间质细胞MAPK 的影响［J］.2010，16(3) :212-216.

［8］高慧艳，李春阳，苏晓东，等.氯化锰对大鼠睾丸间质细胞睾酮合成及去势大鼠生殖内分泌的影响［J］.2010，45(3) : 419-422.