李亚科种质资源的超低温保存技术研究进展

朱东姿，王甲威，陈新，魏海蓉，刘庆忠

(山东省果树研究所/农业部黄淮地区果树科学观测实验站，山东泰安 271000)

李亚科，又称梅亚科，桃亚科，属于蔷薇科。全世界李亚科包含10个属，约有300多种，主要分布在北温带地区，中国有9个属，约有170余种，其中5个属原产于中国[1]，有着几千年的栽培历史，因此中国拥有丰富的李亚科栽培和野生植物资源[1]。许多种属的果实色泽鲜艳，风味甘美，营养丰富，如桃、杏、樱桃等，也有许多种属的种子是重要的干果和油料，如杏仁、扁桃仁等，还有种属的花具有观赏价值，如梅花、樱花、碧桃、榆叶梅等。但由于人为干预越来越多，中国农业植物资源遭到严重的破坏和侵蚀，野生资源在原生地已很难找到，加上外来物种和商业品种的大力推广使得野生物种数骤减、地方品种大量被淘汰，生产上种植的许多主栽品种遗传基础日趋狭窄，存在遗传脆弱性的隐患。

超低温保存被认为是对植物种质资源进行长期保护的一种理想手段。超低温保存，是指在超低温(-196℃)条件下抑制种质细胞内一切新陈代谢活动，使细胞处于一种“暂停”状态而不丧失活性的一种保存技术[2]。超低温下种质细胞内代谢机制类似静止的，从理论上看超低温贮藏的时间是可以无限的，而且贮藏过程中的生理和遗传变化能够控制在最低限度内，是最有希望进行基因资源长期保存的方法[2]。超低温保存在果树等木本植物上的研究远远落后于水稻、马铃薯等作物，而且超低温保存在李亚科植物上的研究又远远落后于苹果、梨等其他果树[3,4]。笔者总结了最新的超低温保存技术，阐述了李亚科植物超低温保存的研究进展，分析了超低温保存技术存在的问题，并对应用前景进行了展望。

1 超低温保存方法

依据原理可将超低温保存方法分为两类：一类是依据冷冻脱水的原理结合程序降温的传统保存技术，另一类是依据植物细胞玻璃化原理采取快速降温方式的新技术。超低温保存新技术的主要步骤如图1。

图1 常见超低温保存方法过程示意图

1.1 材料选择

超低温保存的种质材料中传统的种子、花粉等材料已逐渐被茎尖和芽等分生组织所取代，尤其是休眠芽和茎尖能解决组织培养后代遗传稳定性问题，植物茎尖已在种质超低温保存中作为主要材料运用[4]。不管是什么材料，含水量越低，细胞液泡化程度越低，冷冻保存存活率越高[4]，材料对超低温保存效果影响很大。因此，应根据植物本身特点来选择适宜的材料类型。

1.2 预处理

保存过程中材料的生理状态对于超低温保存的成功起着关键作用，因此在超低温保存过程中必须保证材料具有最大的脱水耐受性和强劲的复苏能力[2]。一般预处理包括两种方法，一是整体植株的低温驯化，如休眠芽要经过冬天的寒冷锻炼，离体茎尖要经过低温锻炼等。二是对外植体进行预培养。

低温驯化是保证植株具有脱水耐受性的重要步骤，能提高果树超低温保存的成活率，如苹果、梨、甜樱桃、桃[5-8]等。一般认为，低温锻炼可以提高细胞生物膜磷酸脂的不饱和程度，还可以诱导植物体内产生保护性物质如脱落酸(ABA)、抗冻蛋白及渗透调节物质，从而产生抗冻效果[5]。

预培养是保证超低温保存成活率的另一重要过程[9]。预培养的目的是进一步降低材料含水量、增加材料含糖量、提高胞液的渗透势，减少液氮冻存过程中细胞内水分子结冰对细胞膜的伤害，不过预培养液浓度过高同样会对细胞造成伤害而降低存活率[9,10]。预处理可以是上述两种方法的结合或选择其一，具体操作根据材料的特性而定。譬如，利用玻璃化法保存甜樱桃品种时可以延长预培养时间来代替低温驯化[10]。

1.3 脱水或玻璃化

脱水或玻璃化是减少细胞内自由水含量，避免在冷冻过程中冰晶对细胞的损伤[2]。在冰冻前，使用高浓度的复合冰冻保护剂(玻璃化溶液，PVS)，在25℃或0℃处理一段时间，诱导脱水，然后直接浸入液氮中，此时冰冻保护剂溶液和保存材料一同进入玻璃化状态。用玻璃化溶液进行脱水处理是玻璃化冷冻成功的关键，要小心控制脱水程序，以防止化学毒性和过度渗透造成的伤害。甘油、乙二醇、二甲亚矾是小分子物质，在细胞内结合水分子，减少细胞内自由水，但这些分子对细胞有化学毒性。蔗糖、甘露糖属非渗透型抗冻剂，不能进入细胞，它使溶液呈胶状而不结冰，从而避免细胞外冰晶对细胞的伤害[11]。因此优化PVS、处理时间和处理温度是玻璃化的重要步骤。赵艳华发现马哈利樱桃使用PVS3成活率最高[6]。笔者研究也发现甜樱桃砧木吉塞拉5和吉塞拉6用PVS3成活率最高[7]，但欧李茎尖使用PVS2处理后植株再生率最高[30]。

脱水法中最常用的是包埋-干燥和包埋-玻璃化法[12,13]，即采用藻酸钠包埋技术将材料在包埋丸中脱水或玻璃化，再用液氮保存。离体茎尖包埋法操作程序：剥取经低温锻炼的离体茎尖，预培养后包埋到含3%藻酸钠中，在无菌空气中干燥或玻璃化处理，随后投入液氮保存。其中包埋干燥法避免了玻璃化溶液对材料的毒害作用，因而保存中茎尖的损伤更小，也更容易恢复。

1.4 冷冻

传统技术常是两步降温法，先降到一定温度稳定后，再投入液氮。新方法一般是玻璃化后或干燥后直接投入液氮。一般贮存过程不会发生伤害。只要保证补充液氮，就可以长期保存材料。

1.5 解冻

解冻的速度是超低温保存的关键，保存后的材料在升温时，细胞内会再次结冰，因此解冻时应迅速通过冰晶生长区，避免细胞再次结冰[2]。若解冻温度及时间掌握不好，会不同程度地引起细胞内结冰而造成伤害。果树离体材料超低温保存后一般采用37～40℃水浴快速解冻。但是杏种子以缓慢降温的方法保存到液氮中，经缓慢解冻后成活率可达到91.5%[14]。因此，需要根据不同植物材料类型及超低温保存前的处理确定其解冻方式。

1.6 培养

经超低温保存的材料不可避免地会受到一定程度的伤害，如对光敏感，为了减少恢复培养过程中的光抑制，超低温保存后的材料通常先在黑暗或弱光下培养1～2周，然后再转入正常强度光照条件下培养。

2 李亚科植物的超低温保存

与其他作物一样，李亚科植物早期的超低温保存研究采用传统方法进行。自20世纪80年代末90年代初发明了新的超低温保存技术，现在各种超低温保存方法在李亚科植物资源保存中都得到应用(表 1)。

种子。果树一般都是高度的杂合体，产生的种子也是高度多样化的，收集野外果树资源的种子是收集、保存野生果树资源多样性的好方法。前人研究发现含水量是超低温保存种子最重要的因素。含水量为6.9%带有内果皮的杏种子，以缓冻缓解的方式保存，成活率可达到91.5%。去掉内果皮的含水量为7.1%的种仁，以上述方式保存，成活率也可达到88.2%[14]。含水量为10.85%的酥李种子也可以成功进行超低温保存[15]。稠李种子含水量在3.5%～15%都可进行超低温保存，但17%以上就无法保存[16]。Marcin Michalak建议将甜樱桃砧木马扎德的种子干燥到含水量为16.8%～20.2 %，过高和过低都不利于超低温保存[17]。

花粉。花粉的长期保存可有效解决杂交育种花期不遇的问题，同时也为花粉培养、遗传转化研究提供技术支撑，是有特殊价值的资源。超低温保存中花粉含水量是关键影响因素。常用的脱水方式是干燥脱水法，扁桃、桃、杏等植物花粉利用干燥脱水法比玻璃化脱水法成活率更高[18-21]。不同桃品种的花粉适宜于超低温保存的含水量也差异很大，为5.0%～37%[18-20]。杏的花粉也有类似现象，不同品种杏的花粉含水量在9.7%～20.8%都可[21]。但在中国樱桃‘红枫湖’花粉超低温保存过程中发现，干燥时的温度对花粉保存的影响大于含水量[22]，推测可能是干燥时温度过高导致花粉失活。因此，对于某些植物的花粉，干燥时应该选择低温进行。此外，解冻方式对超低温保存花粉的成活率也有影响，腊梅花粉解冻的时候用水浴快速化冻效果较好[23]。但是对于梅花粉，化冻方式没有影响[24]。因此不同植物、不同品种的花粉进行超低温保存都需要摸索最适宜的方法，要针对含水量、脱水方法、脱水时间以及解冻方式设计试验。

休眠芽。目前休眠芽的超低温保存研究主要集中在苹果上[25]，李亚科植物仅有杏和扁桃休眠芽的超低温保存获得成功。王彩虹通过两步法成功保存了杏休眠芽，成活率达100%[26]。肖巍、姜喜利用玻璃化法和小滴玻璃化法保存扁桃休眠芽成活率分别是61%和80%[27,28]。

离体茎尖。茎尖分化程度低，遗传物质稳定，在离体条件下容易再生植株，是超低温保存最常用的材料。国内外已发表的李亚科超低温保存文献中，有49%的材料是茎尖(表1)。自1992年，Niino利用玻璃化法成功保存苹果和李的离体茎尖[29]，各种超低温保存技术在桃、李、杏、樱桃等离体茎尖保存中已有大量研究[5-8,29-30]。其中杏主栽品种Nonpareil通过玻璃化法比包埋-脱水法成活率更高[31]，Shatnawi发现包埋-干燥法更适合甜樱桃的一些品种[32]。樱桃李利用包埋法成活率比小滴玻璃化法高[33]。扁桃离体茎尖通过玻璃化法、包埋-玻璃化法和包埋-干燥法都可以成活，但玻璃化法成活率最高[34]。

其它材料。除了种子、花粉、茎尖可以通过超低温保存，杏、甜樱桃野生种等植物的离体胚、原生质体、悬浮细胞系等也都获得成功[35]。其中原生质体和悬浮细胞系作为遗传转化的材料，利用超低温保存便于随时使用，节省了每次繁琐的制备工作，具有重要的意义。因此，选择适宜的复合冰冻保护剂，摸索合适的处理时间对原生质体和悬浮细胞系的超低温保存十分重要。

3 超低温保存在李亚科植物中的其他应用

超低温保存技术除了应用于植物种质资源的保存外，还应用于脱毒、抗性育种和遗传转化，其中超低温脱毒是目前研究的热点。1997年，Brison用超低温成功脱除李属砧木茎尖中的李豆病毒，脱毒率达到50%，开创了超低温疗法[36]。超低温疗法，即超低温脱毒，通过超低温选择性地杀死细胞，一般认为带病毒的分化细胞含水量高，在冷冻过程中会形成冰晶而被杀死，相反，不带病毒的分生细胞的细胞质浓度大，冷冻后能存活，但目前对于超低温脱除病毒的分子机理尚不明确[37]。通过超低温疗法可对感染病毒、支原体和细菌的植株进行脱毒处理。目前，已成功脱除李属砧木、苹果、香蕉、葡萄等植物中的各种病毒，以及甘薯的小叶支原体和柑桔的黄龙病[37,38]。

4 超低温保存中存在的问题及前景展望

超低温保存是目前果树类植物遗传多样性长期保存的理想方法。不少种类的种质细胞都可在超低温条件下保存，随着超低温保存技术的发展，可以保存的材料范围也在不断扩大。目前，超低温保存技术面临的问题主要有以下几点：①超低温保存技术虽然已经成功地应用于上百种植物，保存的材料也非常广泛，但没有形成普遍适用于各种植物的超低温保存技术体系，有的研究是一个材料一个方法，换个新材料，方法就要重新摸索一遍，这也是整个超低温保存的瓶颈，限制了大规模实际应用。应加强超低温保存技术的研究，特别是广谱的保存方法。②目前超低温保存的研究多侧重于保存技术的试验，对冻存机理的研究尚不深入。下一步应加大分子机理的研究。③中国大部分李亚科植物都分布在北温带地区，相比于离体茎尖来说，休眠芽更容易得到，具有更省时、省力、节约成本的优势。因此，加强休眠芽的研究是非常重要的。④果树病毒病已严重危害果树产业的健康发展，要利用好超低温疗法，加强病毒脱除机理研究的同时解决产业问题。