非洲猪瘟检测方法研究进展

刘厚荣，张 强，钱 明

（1.上海海关学院检验检疫技术交流部，上海 201204；2.上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200003）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染而引发的一种只在家猪和野猪中传播的发病快、病程短、病死率高达100%的接触性传染病，是世界动物卫生组织（Office international desépizooties，OIE）规定的法定报告动物疫病，也是我国重点监控防范的一类动物疫病[1]。该病于1921年在非洲肯尼亚被首次报道，随后流传至西欧及拉美国家。我国于2018年8月确诊首例非洲猪瘟病例，随后在全国呈爆发性流行传播，给我国生猪产业带来沉重打击[2]。

ASF疫苗开发过程中灭活或亚单位疫苗难以诱导中和抗体，减毒疫苗虽最具开发潜力，但也面临难以通过传代途径获得安全有效的弱毒疫苗，疫苗开发工作仍在安全性、有效性、生产工艺、生产成本等诸多方面存在问题[3]。“隔离—扑杀—销毁—消毒”是目前阻断ASFV传播重要方式，因此，快速精准的检测手段是非洲猪瘟防控的关键措施[4]。本文总结了国内外对ASF检测技术的最新进展，以期为ASF的高效诊断提供参考。

1 ASFV分离和猪红细胞吸附检测

ASFV分离结合猪红细胞吸附检测（HAD）是OIE推荐的检测金标准之一，HAD测试的阳性结果被认定为是ASF感染诊断的决定性因素。然而，该技术也由于原代培养细胞对检测过程的高技术标准要求，操作过程中易于出现假阴性，且检测反应耗时长，目前通常被作为其他检测方式的辅助诊断。近年来，针对该技术的细胞培养技术有了很大提升，Do和Nguyen[5]通过比较评估可用的细胞系与各种培养基因子确定用于复制ASFV的候选商业细胞系，大大提高了HAD检测结果的可靠性。

2 基于分子生物学的检测方法

ASFV基因组约为170～194 kb，编码150余个潜在基因[6]。ASF分子生物学检测方法主要基于ASFV的保守且特异的基因序列，通过特定基因扩增，分析检测目标序列片段。分子生物学检测手段以其准确高效的特点而被检测人员所青睐。

2.1 聚合酶链式反应（PCR）

PCR检测方法是OIE推荐的ASF诊断方式之一，具有灵敏度高、特异性强和检测快捷的优点。目前，大部分诊断用引物通常是根据p72的B646L基因的保守区设计的。近年来，优于OIE推荐引物检测结果而具有更高特异性、敏感性的p72蛋白基因PCR检测方式也在不断更新建立[7]。

2.2 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

qRT-PCR基于其高灵敏度、高准确性而被广泛用于ASFV的检测。最近的qRT-PCR技术优化主要体现在更高灵敏度和较短的检测时间方面。Wang等[8]使用冻干粉试剂建立的qRT-PCR从标本处理到结果报告只需2小时即可完成。此外，任名等[9]建立的以ASFV p72基因为靶标的检测方法，比普通PCR方法灵敏度高100倍。

2.3 微滴数字PCR

ddPCR技术是近年来新兴的一种定量检测技术，不同于qRT-PCR依赖于标准曲线和Ct值的“相对定量”方式，ddPCR可实现单分子水平上的“绝对定量”检测，极大地提高了对微量样品检测的敏感性和准确性。ddPCR技术基于其极高的敏感度和准确性更加适用于ASFV的早期微量检测，在ASFV早期防控及流调溯源、食品加工、食品销售等各痕量检测环节展现了独特优势[10]。

2.4 恒温扩增技术

恒温扩增技术是一种在等温下进行的PCR反应，无需经过高温变性低温退火等温度变化步骤，无需PCR仪，扩增产物也无需电泳检测，只在一个恒温器中便可完成所有反应，在现场快检工作中具有十分广阔的应用前景。

2.4.1 环介导等温扩增法（LAMP）

LAMP技术在链置换DNA聚合酶的作用下，核酸可在60℃～65℃恒温下扩增约15～60分钟，最后根据生成产物的浑浊度判定检测结果，具有灵敏度高、操作简便的优点。最近有研究将产物与荧光染料相结合，建立了易于观察鉴定检测结果的ASFV实时荧光LAMP快速检测方法[11]。

2.4.2 交叉引物扩增技术（CPA）

CPA与LAMP有着“异曲同工”之妙，二者都是通过多个引物设计在恒温状态下对目标基因进行扩增。CAP的特点在于针对目的基因4个或5个区域设计4条或者5条特异性引物，利用具有链置DNA聚合酶在63℃左右条件下进行高效特异地基因扩增。Gao等[12]基于交叉引物扩增技术结合免疫层析条开发了适用于ASFV的现场检测方法（CPA-strip），进一步加强了CAP检测的简便化。

2.4.3 重组酶聚合酶等温扩增技术（RPA）

RPA技术主要依赖于三种功能蛋白：结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶，该技术的最佳反应温度在37℃左右，检测方法灵敏快速且操作简单。最近建立的RPA方法以及结合RPA技术与侧流层析试纸条是ASFV检测qRT-PCR有前途的替代方案[13]。

2.4.4 CRISPR等温扩增技术（CRISPR-AMP）

CRISPR-AMP是近年来新兴的基因检测技术，相比于传统PCR和其他等温扩增技术，CRISPR-AMP技术具有灵敏度高、抗干扰性强、普适性的特点。Bai等[14]构建的结合重组酶辅助扩增和CRISPR/Cas12a的系统可在37℃环境中，一小时内以飞摩尔级的灵敏度识别ASFV靶标，该系统的检测试剂可被冻干到三个试管中，并在4℃储存至少7天时保持相同的灵敏度便于现场持续使用。

2.5 生物传感器

生物传感器是近年来新兴的一种将传统分子生物学信号转变为荧光等易检测判别信号的检测技术。Biagetti等[15]利用DNA/LNA探针与目标DNA序列之间相互作用的可逆性质构建了允许进行多次快速分析的生物传感器，该生物传感器的结果与OIE推荐的qRT-PCR结果具有一致准确性。

2.6 多重PCR（mPCR）

mPCR是在普通PCR的反应体系中同时加入多种针对不同检测对象的特异引物，从而实现在同一反应中对多个目标进行鉴定，具有省时省力的优点。近期的研究表明，通过mPCR所建立的检测体系不仅可用于检测非洲猪瘟的单一感染，也可用于多种病原的混合感染，且检测结果与单一PCR检测结果一致[16]。

3 基于血清学的检测方法

血清学诊断方法基于其简单、成本相对较低、对专用设备要求不高的优势，是目前ASFV常用的诊断检测方式之一。ASFV的血清学检测包括抗原检测和抗体检测，但抗原检测的方法对检测条件要求更为严格。由于目前尚无针对ASFV而推广应用的商业化疫苗，患病个体感染ASFV后并不能彻底中和抗体，因此，ASFV抗体的阳性检测结果可直接表明病毒的感染，然而，有些患病个体也会出现发病十分迅速，还未产生抗体而病死，因此基于抗体的检测方法一般需要结合其他检测手段一并诊断。

3.1 抗体检测方法

3.1.1 酶联免疫吸附法（ELISA）

ELISA是OIE推荐首选的ASFV血清学检测手段，其原理基于ASFV抗原性的结构蛋白为包被抗原而建立的间接检测方式，是目前应用广泛的血清学检测方法。近年来，多种不同抗原包被的检测方式被开发出来[17-18]。

3.1.2 免疫印迹（IBT）

IBT主要利用抗原-抗体的特异性反应，从蛋白混合物中检测出目标蛋白，从而定量或定性地确定检测样品中目标蛋白的存在情况，该技术融合了血清学技术与蛋白质电泳分析方法，具有灵敏度高的特点。Kazakova等[19]基于原核重组表达建立的p30免疫印迹测试系统特异性和灵敏度分别为98.75%和100%。

3.1.3 胶体金免疫层析技术（GICA）

GICA技术较之OIE推荐的ELISA、PCR或qRT-PCR技术，具有操作灵活不受检测仪器限制的优势，非常适用于现场快速筛查。近期，有研究建立的交叉引物扩增-诊断试纸联用免疫层析条及免疫金试纸条不仅具有诊断快速、灵敏度强、结果准确的特点，其痕量检出效果也十分明显[20]。

3.2 抗原检测方法

3.2.1 荧光抗体试验（FAT）

FAT是常用的抗原检测方法之一，也是OIE推荐的ASFV检测技术，其原理是基于荧光物标记抗体来实现对待测样品中相应抗原的鉴定，该技术具有快速、灵敏度高、特异性强的优点。有研究者[21]使用多重荧光微珠免疫分析建立的间接ELISA，对于在ASFV流行地区低毒力ASFV分离株检测具有高特异性。

3.2.2 侧向流动免疫色谱分析（LFIA）

LFIA是一种将免疫标记技术和色谱层析技术相结合的固相膜免疫分析技术，该方法主要借助标记物获得可测量的信号来分析鉴定结果。近年来基于ASFV p72基因所建立的LFIA检测方法展示出了特异性高、快速、易于判读的检测结果[22]。

3.2.3 双抗夹心ELISA（ELISA-double sandwich method）

双抗夹心ELISA的技术特点在于经两步抗原或抗体的识别，通过被酶标记的间接抗原或抗体催化底物扩大显色反应，根据呈色的深浅进行定性或定量分析，具有高敏感度的特点。Hutchings和Ferris[23]对比分析了两种用于ASF诊断的间接夹心ELISA的检测效果，结果表明两种测定法均显示可检测ASF病毒系统发育不同组的代表性野毒株的抗原。

4 小结与展望

2021年以来，我国共报告发生非瘟疫情14起，累计扑杀生猪0.36万头，ASFV防控形势依旧十分严峻[24]。由于目前并没有成熟的商业疫苗可以有效阻断ASFV的传播，因此高效可靠的病毒检测方法仍是ASFV防控进而实现病毒清除的重要一环（表1）。在当前严峻的ASF疫情防控形势下，为适应ASFV现场快速高通量检测排查，应逐步摆脱如酶活、精密的检测仪器、繁琐的检测步骤对检测方法的束缚，朝着高效、高灵敏度、高特异性的方向进行研发，同时，还要注意到现场采样环节中避免疫情扩散的取样要求。为净化ASFV在中国的传播，应结合其传染源、传播途径、易感群体各环节做好传播阻断，加强国外输入风险把控，守卫国门生物安全。