美卡精子密度仪在猪精子密度测定中的应用

曾 敏 ，李 姣 ，姚 立 ，石 挺 ，吕 轩 ，雷 勇 ，李文平 ，※

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.湖南省畜牧水产局，湖南长沙410006）

随着养猪业的规模化发展，猪人工授精技术在生产中的应用越来越多，它具有提高良种利用率、减少疾病传播和降低饲料成本等优势，是目前我国推行猪品种改良最有效的方法[1-2]。公猪精子密度的高低直接决定母猪生产性能和产仔数量，是人工授精的关键[3]。根据《种猪常温精液国家标准》，最常使用的是血球计数板法，其准确率最高，但操作过于繁琐[4]。目前较方便的是分光光度计法，美卡精子密度仪正是基于这一原理研发出的用于测定家畜精液精子密度的一种较先进设备，它的应用使得精子密度的测定变得快速而简便。但目前国内外还没有关于其在公猪精液密度中的实用性报道，本文主要针对其重复性和对不同品种公猪的测定结果进行分析，旨在为美卡精子密度仪在猪精子测定中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及仪器、试剂

大白、长白、杜洛克种公猪，由浏阳仁和种公猪站提供。

美卡精子密度仪，意大利美的科卡动物育种公司制造。血细胞计数板、显微镜等常规试验器具与试剂由湖南农业大学临床实验室提供。

越丰1号长效稀释液由济南洛克工贸有限公司提供。

1.2 试验设计

1.2.1 精液的采集与处理

用手套采精法采集公猪精液，采精前注意剃除包皮周围的被毛，舍弃射精初期的部分和凝胶部分。将精液过滤后用稀释液作梯度稀释，分装在集精瓶中，置于17℃恒温箱中保存。每个品种分别采10头公猪精液，在12h内进行检测。

1.2.2 密度的测定

血球计数板法：先按1:200的比例进行稀释，取20μL稀释好的精液转移到计数板上，5min后在400倍显微镜下进行计数。选取位于计数板中心的5个大格的精子数量，通过换算得出每毫升的精子数量。

精子密度仪测定法：用稀释液将仪器校零后，吸取0.2mL混匀的新鲜精液注入测试瓶中，然后加入9.8mL稀释液，通过移液器混匀后盖上测试瓶盖子；按READ/DIRECT键，等待显示屏上出现一个透光系数，对比说明书得出所测样品的精子密度。

1.3 统计学方法

所得数据采用EXCEL和SPSS17.0统计软件分析，用“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 精子密度仪检测的可重复性和一致性

表1 精子密度仪的可重复性统计分析

从表1可知，同一样品连续检测12次，其精子密度变化很小，数据之间的差异不显著（P>0.05），表明该仪器可重复性良好。变异系数也显示该检测系统具有较好的一致性。

2.2 精子密度仪检测与血球计数法的比较

表2 精子密度仪在杜洛克公猪精液中的使用结果

表3 精子密度仪在大白公猪精液中的使用结果

表4 精子密度仪在长白公猪精液中的使用结果

通过对比分析可知，精子密度仪与计数板检测结果之间有直线回归关系，且不同品种公猪精液中的回归方程有所不同，杜洛克为y=0.6502x+0.0128，大白为y=0.8364x+0.0511，长白为y=0.86x-0.0102。回归关系均达显著水平（P＜0.05），其中大白与长白的回归方程很相似。（式中：y为实际密度，x为系统检测密度)。

从表2、3、4可以看出，精子密度仪换算后结果与计数板所测的猪精子密度结果无显著差异（P>0.05），相关性较好，表明精子密度仪测定猪精子密度有较高的准确性，可以代替计数板法在生产应用中的使用。

3 讨论

目前常用的检测精子密度的方法有血球计数法、分光光度法和流式细胞仪法[5-7]。血球计数法因为操作繁琐，重复性差[8]，在生产应用中较少使用；流式细胞仪法虽无此缺点，但其仪器昂贵，在养殖场中也极少见到[9]。利用分光光度法测定精子密度的方法始于上世纪七八十年代，其具有快速、简便的优点，但由于当时的技术条件不成熟，导致其准确性不高。随着养殖技术的不断提高和一次性滤纸应用使得分光光度法在猪精子密度检测中的应用成为了可能。美卡精子密度仪是由意大利美的科卡动物育种公司出品，用来测定家畜精液中精子密度的一种较先进设备，其原理为在特定波长下测定待检样品的吸光度，通过吸光度与精子密度的函数转换，对样品进行定量分析。

利用美卡精子密度仪检测猪精子密度的结果需要转换的原因是其设定的程序并非是检测猪精子密度，所以需要进行矫正。通过对精子密度仪的重复性和一致性研究发现，该仪器可重复性良好，具有较好的一致性。应用精子密度仪对不同品种公猪精液进行检测，对比计数板的结果发现二者具有显著的直线回归关系。经换算，精子密度仪与计数板法所测结果无显著差异，表明其准确性较高。测得的密度值偏大可能是因为测定用的玻璃杯在使用过程中有一些磨损导致透光率下降或者操作时间较长，水分蒸发所导致。试验结果显示，大白猪和长白猪的回归方程相似，与杜洛克的回归方程有较大差异，这可能与品种有关。有报道[10]指出，杜洛克公猪的精子活率和运动能力显著高于大白猪和长白猪。另外，不同品种公猪的睾丸大小、精子畸形率也不一样[11-12]，但究竟是何原因还有待进一步深入探究。试验数据表明，美卡精子密度仪对精子密度很高的精液和精子密度较低的精液准确性不理想，而对精子密度在0.6~2.7亿/mL的精液测定结果最可靠。因此，在检测精子密度之前，建议将原精进行适当4~8倍稀释。种猪常温精液标准中对精子密度的要求是大于1亿/mL，说明美卡精子密度仪能适用生产实际中的需要。

综上所述，美卡精子密度仪具有准确、快速、简便等优点，能取代复杂而繁琐的血细胞计数法在生产实际中的使用，这不仅能提高实验人员的工作效率，还能使精液得到较好的稀释，从而提高精液产品的质量和农户的生产效益。随着养殖条件的不断提高，美卡精子密度仪的应用将逐步扩大。

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