猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒2型、弓形虫混合感染病例的病原学诊断

宋 春，陈 静，2，成虹松，2，李 梅，2，李 涛，程振涛，2*

(1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008)

2020年8月，贵州省龙里县某猪场的育肥猪群发病，病初精神沉郁、食欲下降、被毛杂乱、呼吸困难，耳部、四肢皮肤轻微发绀，胸下及腹下皮肤出现红斑，后陆续死亡。发病数198头，发病率25%，死亡96头，病死率48.5%。为确诊病因，对5头病死猪进行解剖并采集病料组织，在流行病学调查及初步临床诊断的基础上开展实验室检测诊断，为该养殖场疫病的准确防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 检测病料无菌采集猪场5头病死猪的肺脏、淋巴结、扁桃体、肾脏、肝脏组织样品作为检测病料。

1.2 主要试剂猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)通用型实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测试剂盒、猪伪狂犬病病毒(PRV)实时荧光定量PCR检测试剂盒(购自北京世纪元亨公司)；2×TaqPCR MastreMix(购自天根生化科技有限公司)；DNA/RNA提取试剂盒、DL 2 000 DNA Marker(购自大连宝生物工程有限公司)；鲜血营养琼脂培养基(自制)。

1.3 主要仪器T20 型双槽梯度 PCR 仪(购自杭州朗基科学仪器有限公司)、Tanon 1600型全自动数码凝胶成像系统(购自上海天能公司)、HH-2型数显恒温水浴锅(购自常州金坛良友仪器有限公司)、CX33O型OLYMPUS 生物显微镜(购自上海普赫光电科技有限公司)。

1.4 引物参照 GenBank 数据库猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF1基因序列(登录号：KM191124.1)，应用 Primer 5.0 软件，设计1对特异性引物(PCV2-F：5’-CGCTGGAGAAGGAAAAATGG-3’；PCV2-R：5’-AAGGGCTGGGTTATGGTATG-3’)，引物Tm值56 ℃。参照 GenBank 数据库弓形虫(Toxophasma)RH株B1基因序列(登录号：AF179871)，设计1对特异性引物(T-F：5’-CGCTGCAGGGAAGACGAAAGT TG-3’；T-R：5’-CGCTGCAGACACAGTGCATCTG GAT-3’)，引物Tm值55 ℃。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5 细菌分离培养鉴定将5头病死猪的肺脏、淋巴结、扁桃体、肾脏、肝脏组织样品分别无菌划线接种于鲜血营养琼脂培养基，37 ℃培养24 h，观察细菌分离培养结果。

1.6 组织样品DNA、RNA的提取取5头病死猪的肺脏、淋巴结、扁桃体、肾脏、肝脏组织各1 g，每头猪组织样品混合于灭菌研钵，加入适量 PBS液，充分研磨，8 000 r/min、25 ℃离心2 min，提取上清液100 μL，用DNA/RNA试剂盒于26 ℃室温环境下分别提取5头猪样品的总DNA/RNA。

1.7 相关病原核酸检测

1.7.1 PRRSV核酸检测分别以提取的各组织样品总RNA为模板，构建qRT-PCR反应体系25 μL：无菌无核酸酶水5 μL，qRT-PCR反应液12.5 μL，酶混合液1.0 μL，荧光探针4.5 μL，模板RNA 2 μL。反应条件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共40个循环。以Cq值≤35并出现特定的扩增曲线判定为阳性。

1.7.2 PRV核酸检测分别以提取的各组织样品总DNA为模板，构建qRT-PCR反应体系20 μL ：无菌无核酸酶水5.9 μL，PCR反应液10 μL，荧光探针 2.1 μL，模板DNA 2 μL。反应条件：95 ℃ 2 min ；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共40个循环。根据阳性对照标准，以Cq值≤30并出现特定的扩增曲线判定为阳性。

1.7.3 PCV-2核酸检测分别以提取的各组织样品总DNA为模板，采用PCR方法进行PCV-2核酸检测。PCR扩增体系25 μL：2×TaqMastreMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，灭菌双蒸水8.5 μL。反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循环35次；72 ℃延伸 10 min。取PCR产物 8 μL于含核酸染料的1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，于凝胶成像系统观察结果(预扩增片段353 bp)。

1.7.4 弓形虫核酸检测分别以提取的各组织样品总DNA为模板，采用PCR方法进行弓形虫核酸检测。PCR扩增体系25 μL：2×TaqMastreMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，灭菌双蒸水8.5 μL。反应条件：94 ℃ 3 min；循环94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环35次；72 ℃延伸10 min。取PCR产物10 μL于含核酸染料的1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，于凝胶成像系统观察结果(预扩增片段319 bp)。

M ：2 000 bp分子质量标准；+：阳性对照；1～5：5头猪组织样品；-：阴性对照图4 弓形虫 PCR检测结果

2 结果

2.1 细菌分离培养鉴定5头病死猪的肺脏、淋巴结、扁桃体、肾脏、肝脏病料中均未分离培养出细菌，表明无细菌感染。

2.2 相关病原核酸检测结果

2.2.1 PRRSV核酸检测由图1可见：阳性对照Cq值为29，3、4、5号猪检测样品中Cq值<35，表明3、4、5号猪组织样品中存在PRRSV感染。1、2号猪检测样品Cq值均>35，说明1、2号猪组织样品中不存在PRRSV感染。

+：阳性对照；-：阴性对照；AS1～5：5头猪组织样品图1 PRRSV qRT-PCR检测结果

2.2.2 PRV核酸检测由图2可见：阳性对照Cq值为23.2，5头猪检测样品Cq值均>30，说明组织样品中均不存在PRV感染。

+：阳性对照；-：阴性对照；AS1～5：5头猪组织样品图2 PRV qRT-PCR检测结果

2.2.3 PCV-2 核酸检测由图3可见：5头猪检测样品均出现353 bp目的条带，与阳性对照相符，表明5头猪组织样品均存在PCV-2感染。

M：2 000 bp分子质量标准；+：阳性对照；1～5：5头猪组织样品；-：阴性对照图3 PCV-2 PCR检测结果

2.2.4 弓形虫核酸检测由图4可见：3、5号猪检测样品出现319 bp目的条带，与阳性对照相符，表明3、5号猪组织样品存在弓形虫感染。1、2、4号猪检测样品未出现目的条带，说明1、2、4号猪组织样品中不存在弓形虫感染。

3 结论

通过对5头病死猪送检组织样品进行细菌分离培养鉴定和相关病原核酸检测，结果表明：该猪场病例存在PRRSV、PCV-2、弓形虫混合感染。

4 讨论

4.1猪感染PRRSV可引起严重的免疫抑制，继发多种病原体感染，造成发病猪群的死亡率大幅升高[1]。感染妊娠母猪主要表现为呼吸困难、繁殖障碍；仔猪、保育猪主要表现为高热、消瘦、呼吸困难、运动失调、耳部和体表皮肤发紫等症状(俗称蓝耳病)，发病率和死亡率高[2]。近年来高致病性PRRSV 变异株的出现进一步加大了该病的防控难度，给养猪业带来严重的经济损失[3]。PVC主要有3种类型：PCV-1、PCV-2和近年来新发现的PCV-3。PCV-1不致病，PCV-2是当前猪群中最主要的致病病毒之一，而PCV-3的致病性还有待进一步研究[4,5]。PCV-2是断奶仔猪多系统衰竭综合征、皮炎与肾病综合征的主要病原，临床症状以病猪渐进性消瘦或生长迟缓、精神沉郁、呼吸困难、咳嗽为主要特征。PCV-2对猪群的危害主要是引起免疫抑制，使疫苗接种不能产生充分免疫应答，易与其他病原混合感染[6,7]。弓形虫是1种专性细胞内寄生原虫，感染后病猪出现厌食、呼吸困难、肌肉无力、腹泻等症状，造成病猪免疫力低下，死亡率可达60%，给养猪业造成很大的经济损失[8]。随着集约化程度的提高和养殖密度的增大，养殖场多种病原混合感染现象比较常见，单纯依靠养殖经验或临床诊断往往不准确，需要进行实验室检测[9]。

4.2近年来国内外有关PRRSV与PCV-2混合感染报告较多，已引起广泛关注。我国猪群中PRRSV 与PCV-2混合感染现象较为严重，这2种病毒均可导致免疫抑制，相互促进病毒在猪体内的复制，导致严重的临床症状和病理损伤[10]。本次检测也证实该猪群存在较严重的PRRSV与PCV-2混合感染。此外，常见的混合感染还有PRRSV与PRV、猪细小病毒(PPV)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，PM)等，但与弓形虫的混合感染较少见。PCV-2的免疫抑制可能诱发弓形虫病，而混合感染引起的免疫刺激可能导致PCV-2的广泛复制[11]。弓形虫病和蓝耳病、链球菌病、猪肺疫、猪圆环病毒病等都表现出高热、呼吸困难、肺脏出血等特征，临床症状、剖检病理变化等方面十分相似[2]。因此猪场出现疑似疫情时，应及时请专业机构进行实验室检测，明确病因，积极采取防治措施，减少发病和死亡。