新城疫、禽流感血凝抑制试验解析

时间：2024-05-28

杨丽仙孙艳平* 肖桂萍周显珍王乔平董昱廷

（1，云南省曲靖市动物疫病预防控制中心 655000；2，云南省曲靖市兽药饲料监察所 655000）

血凝与血凝抑制试验(HA-HI 试验) 具有经济、快速、可靠、操作简便的特点，可在短时间内处理大量样品报告禽类血样的抗体水平，是我国各地防疫监督机构和养殖场进行流行病学调查、疾病诊断及免疫效果监测的主要方法之一。实践中，HA-HI 试验的操作易受样品、试剂、器材、人员、环境等因素影响，使其敏感度、准确度降低，造成试验结果偏差，甚至误判，只有充分理解试验的各方面实质和要领，才能熟悉应用好本试验原理。

1 原理

细菌、红细胞等颗粒性抗原或表面覆盖、吸附抗原的颗粒性物质，与相应抗体（免疫血清、疫病恢复期血清）结合后，在电解质参与下，经过一定的时间，颗粒抗原被凝集形成肉眼可见的团块，这类试验统称为凝集试验，新城疫、禽流感许多病毒的包膜中含有按病毒密码合成的蛋白质，这种蛋白质（血凝素）有凝集某些动物红细胞的能力，称为红细胞凝集，简称血凝(HA) 试验。血凝试验能被相应的特异性抗体抑制，阻断病毒颗粒表面的抗原与红细胞凝集，先使抗体与病毒结合，血凝素不能吸附于红细胞表面的受体上，红细胞将进行自然下落，沉降到V 形孔底部，这种红细胞凝集抑制试验简称血凝抑制(HI) 试验。

2 材料与方法

2.1 材料

微量移液器、96 孔微型血凝反应板、微量振荡器、加样槽、微量移液器枪、新城疫（禽流感）标准抗原、阳性血清、阴性血清与待检血清、1%鸡红细胞悬液、PBS 液。

2.2 方法步骤

2.2.1 1%鸡红细胞悬液配制

（1）为避红细胞自凝现象，配制1%红细胞悬液时应采集3只SPF 鸡或未免疫的成年公鸡血液（抗凝剂与血液比例为1：4，每只鸡的红细胞分别抗凝保存）。

（2）将抗凝红细胞加入10ml 离心管中，加入3～4 倍体积生理盐水，以2000～3000r/min，离心5～10min，弃去上液和红细胞上层的白细胞薄膜，再加入10 倍以上血量的生理盐水，上下缓慢颠倒或用吸管轻轻吹打数次（切忌用力过大使红细胞破裂），使其充分混匀，再离心弃去上清液，反复离心、洗涤3～5 次（如果不能确保供采红细胞公鸡是否免疫过，可多洗1～2 次）直至上清液清亮透明为止。用吸管轻轻吸走上层上清液和白细胞、血小板备用。

图1 全血离心后实物图

（3）用生理盐水配制1%的红细胞工作液（为保证不取到杂质和破坏红细胞，吸取红细胞时，吸取过程中吸口保持在液面下，接近离心管底处慢吸慢出）。

2.2.2 血凝试验（4 单位抗原的制备）

（1）用灭菌的生理盐水按说明稀释、混匀新城疫、禽流感病毒。

（2）取96 孔V 形微量反应板，加生理盐水或PBS 作稀释液。

（3）吸取0.025ml 新城疫（禽流感）病毒均匀悬液分别加入第1 孔，移液器吹打3～5 次充分混匀，从第一孔中吸取0.025ml 混匀后的病毒液加到第二孔，混匀后吸取0.025ml 加入第三孔，依次进行倍比稀释到第十一孔，从第十一孔吸取0.025ml 弃之，换吸头。

（4）加0.025ml 稀释液（可以理解为补液，使每孔的总反应体积和后面的HI 试验统一成75ml，确保不让肉眼和液体表面张力等因素差异而影响结果的判定）。

（5）加0.025ml 1%鸡红细胞悬液（轻缓、充分混匀红细胞液，摇动容器时不能用力过猛而使红细胞破裂）振荡混匀，室温20～25℃下静置40min 后观察结果，也可4℃静置60min，生理盐水对照孔的红细胞成明显的纽扣状沉淀到孔底时判定结果。

（6）在生理盐水对照孔出现正确结果的情况下，将反应板45°角倾斜，看红细胞的凝集程度（可从反应板的背面观察）。完全凝集的病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU），1个血凝单位稀释倍数除以4 即为含4HAU 的抗原的稀释倍数。

2.2.3 血凝抑制试验

血凝抑制试验方法是将受检血清与标定好的抗原发生充分反应，从而达到抑制病原和红细胞凝集。

（1）在微量反应板中加入0.25ml 生理盐水。

（2）分别吸取0.25ml 血清样本、阴性、阳性对照样品加入各自设定排的第1 孔，依次倍比稀释至设定的最后孔。从最后孔吸取0.025ml 弃之，换吸头。

（3）除空白对照外，其他各孔加入4HAU 混匀的病毒抗原液0.25ml，室温（约20℃）静置至少30min。

（4）每孔加入0.25ml 体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置40min（约20℃）。

（5）结果判定：对照红细胞将呈现纽扣状完全沉淀于孔底（周边液体透明清亮）时判定结果。

以完全抑制4 个HAU 抗原的血清最高稀释倍数作为HI 滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于2 log2，阳性对照孔血清误差不超过1 个滴度的试验结果才有效。

3 讨论

3.1 本试验采用4 单位的抗原

一方面跟人们认识事物的习惯有关，人们目测实物时通常会把整件物品意向地分成4 等份，同样把血凝反应程度分成相等的4 份：出现大的凝集片或小的颗粒状物，液体完全透明，为全部凝集，记作++++；有明显的凝块，液体几乎透明，也可以理解成有3/4 凝集，1/4 不凝集，记作+++；有可见的凝集块，液体半透明，可以看有2/4（一半）凝集，一半的不凝集，记作++；液体浑浊，仅可见少数颗粒状物，可理解成有1/4 凝集，3/4 不凝集，记作+；液体均匀浑浊，无任何凝集物，记作—。

另一方面是试验实际经验的必然，我们知道抗原与抗体或红细胞是按一定比例结合的，当比例合适时结合最充分，复合物最多，反应最明显，结果出现最快，我们称之为等带；如果比例不当，抗原或抗体过剩时，未被结合的抗原或抗体会游离在液体中，出现前带现象，呈现微凝集和不凝集。实践证明，免疫血清抗体的量是绝对充裕，充裕到从1：2～1：4096 甚至更高后恰好适合和4 倍抗原相结合。

3.2 测定抗原效价

在测定抗原效价时，如果遇到所做的几排平行血凝试验出现在相邻滴度之间无法确定的情况，可取中间值或中间偏前或后的1/4 值，测定情况见图2，第一、二排的第9 孔刚好完全凝集，滴度为1：512；第三、四排在的8 孔刚好完全凝集，滴度为1：256。可以按两个滴度的中间值1：384 来配抗原，4 倍血凝单位抗原所对应的稀释比例就为1：96。注：256+（512-256) ÷2=384，384÷4=96。

图2 抗原效价测定情况图

3.3 4HAU 抗原液反测

在测定抗原效价时很容易引起较大误差，可以从反方向来测看所配制的抗原是否最接近真正意义的4 倍抗原：在稀释板上生理盐水0.025ml，把已经配好的抗原工作液按倍比稀释，后依次每孔加0.025ml 生理盐水和1%的鸡红细胞悬液，轻轻混匀，静置40min（约20℃），实时观测结果，如果这时1：4（理论值应该为1HAU）稀释的孔刚好完全凝集，说明我们所配抗原就是4 倍抗原；如果是1：2 稀释的孔刚好完全凝集，所配的抗原不是4 倍而是2 倍抗原，就需要按要求加抗原原液来使其达到4 倍抗原；如果是1：8 稀释的孔刚好完全凝集，所配的抗原不是4 倍而是8 倍抗原，那么就可以在已配抗原液中添加生理盐水使其稀释为4 倍抗原液。