山东省水貂养殖场流感病毒防控及感染情况调查

薛瑞雪 陈峰 蔺晓月 张栋 王苗利 王贵升* 周业森

（1，山东省动物疫病预防与控制中心 250100；2，青岛农业大学动物医学院 266109）

A 型流感病毒属于正黏病毒科流感病毒属，是一种有囊膜的单股负链RNA 病毒。根据血凝素（Hemagglutinin,HA）与神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）的抗原性差异，目前将A 型禽流感病毒分为18 种HA 亚型和11 种NA 亚型，其中大部分亚型流感病毒来源于禽类[1]。自1994 年我国首次报道鸡群中分离出H9N2亚型禽流感病毒以来[2]，该亚型流感病毒在我国广泛存在，持续困扰养禽业[3,4]。

水貂是一种常见的经济动物，水貂养殖业也是山东省畜牧业的重要组成部分。近几年国内外关于水貂感染流感病毒的报道日益增多，2015 年，我国东部地区两个水貂场爆发了H5N1亚型禽流感病毒，给当地养貂业造成较大的经济损失[5]。而H9N2亚型禽流感病毒在水貂群传播过程中，有的毒株已获得适应哺乳动物突变，使其更容易感染水貂及人类[6]。因此，禽流感病毒在给水貂业带来巨大经济损失的同时还存在潜在的公共卫生风险，所以，加强对水貂流感病毒的监测和防控可避免造成公共卫生安全隐患。

1 调查方法

1.1 网上问卷调查

网上设置调查内容：养殖场地点、饲料种类、养殖环境、免疫接种等问题。将问题发送给山东省主要的水貂养殖户填写调查问卷。经过30d 共收集不同地市养殖户114 家，对调查结果进行整理、汇总，得到相关数据。

1.2 样品采集及检测

1.2.1 样品及主要试剂

2020 年8 月～12 月从威海、泰安、菏泽、潍坊水貂养殖场共采集181 份发病水貂肺脏器官。

Prime Script One Step RT-PCR kit Ver.2、RNA 抽提试剂TRIzol、Gel Extraction Mini Kit、pMD18-T 克隆载体、Top 10 感受态细胞、DL2000 DNA Marker 均购自TaKaRa 公司；A型流感病毒荧光定量RT-PCR 检测试剂盒；H9亚型、H7亚型和H5亚型禽流感分型荧光定量RT-PCR 检测试剂盒购自世纪元亨动物防疫技术有限公司。

1.2.2 样品检测

取适量各病料组织置于离心管中，加入适量的pH 7.2 的PBS 研磨成匀浆，反复冻融3 次，8000 r/min 离心5 min，取各病料上清液200 μl，按照RNA 提取试剂盒说明书从病料中提取RNA，以其为模板，采用A 型流感病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒对121 份样品进行检测。

1.2.3 引物设计

根据GenBank 收录的有关流感病毒序列，用Primer 5.0 设计流感病毒HA 和NA 扩增引物（表1）。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

表1 全基因扩增引物

1.2.4 目的基因的RT-PCR 扩增与克隆测序分析

取各病料上清液200 μl，按照TRIzol 说明书方法提取样品总RNA。一步法RT-PCR 反应体系总体积为50 μl：2x1 Step Buffer 25 μl，Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2 μl，引物（10 μmol/L）各2 μl，RNA 2 μl，RNase Free ddH2O 17 μl。反应条件为：50 ℃30 min，95℃3 min，1 个循环；94 ℃30 s，53℃30 s，72 ℃1 min，32 个循环；72 ℃10 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。胶回收产物克隆至pMD18-T 克隆载体由上海生工生物工程技术有限公司测序中心进行测序鉴定。

2 结果与分析

2.1 水貂饲料种类

养殖场饲喂饲料的种类有生鲜料，熟化后加工饲料和颗粒料。而生鲜料由于没有经过熟化，常可作为一些病毒细菌的传染源。其中流感病毒可通过饲喂未熟制加工过的生鲜饲料感染水貂。对潍坊、日照、菏泽、威海、滨州5 个地市114 家水貂养殖场进行了调查问卷，由图1 可知，在水貂饲料中生鲜料所占比例较大，尤其是潍坊地区生鲜饲料所占比例最大，而潍坊地区不靠近海，生鲜饲料主要以禽类产品为主，这也为禽流感病毒在水貂中的传播带来了更大的可能。

图1 不同地市生鲜料使用情况

2.2 养殖场养殖模式、周围环境有害传播媒介及应对措施

经调查，大部分水貂养殖属于院舍式养殖模式，周围活动的野鸟也会为流感病毒的传播带来可能。由图2 可知，养殖场周围有野鸟活动的养殖场36 家，占总养殖场数量的31.58%，这些养殖场在棚舍内放置药饵对鸟类进行诱杀（占8.77%），有些养殖场使用专用料盖遮挡（占5.26%），也有些喷洒专用药物（占7.02%），这措施在一定程度上减少了鸟类对水貂健康养殖的影响。但仍有一部分水貂养殖场未采取相应的措施（占10.53%），这将增加水貂感染的可能性。

图2 养殖场周围环境及采取措施

2.3 发病水貂处理方式

由图3 可知，水貂发病后仍有部分养殖场未经消毒直接销售，给流感病毒的传播带来可能。但大部分养殖场都会处理，如无害化处理或消毒后再销售，这说明大部分养殖户有较强的疫病控制意识。

图3 发病水貂处理方式

2.4 流感疫苗免疫接种

经调查发现，当前大多数养殖场的免疫只针对犬瘟热和细小病毒，且目前没有针对水貂流感的商品化疫苗。没有疫苗保护增加了水貂感染流感病毒发病的可能。

2.5 临床样品流感病毒检测

采用A 型流感病毒荧光定量RT-PCR 检测试剂盒对181份样品进行检测，检测结果显示有2 份为流感病毒阳性，这两份病料来源于一个养殖场。经H9亚型、H7亚型和H5亚型禽流感分型荧光定量RT-PCR 检测试剂盒检测显示均为H9亚型禽流感病毒。

2.6 HA 和NA 基因遗传进化分析

为进一步分析本次鉴定毒株的遗传进化关系，依据国内外流行毒株及国内外参考毒株核苷酸序列的同源性，使用MegAlign 软件绘制了HA 基因（图4）和NA 基因（图5）的系统发育进化树。结果表明，该株病毒的HA 和NA 基因均属于Y280-like 毒株，为H9N2亚型禽流感病毒。

图4 H9N2 亚型禽流感病毒HA 基因系统进化树

图5 H9N2 亚型禽流感病毒NA 基因系统进化树

经与养殖场联系发现，该场水貂的饲喂方式为生鲜料饲喂，且养殖模式为庭院式养殖，未采取野鸟控制措施，并未免疫流感疫苗。这有可能是该养殖场饲喂了发病禽的生鲜料导致水貂感染流感病毒。

3 讨论

流感病毒为RNA 病毒，基因组很容易发生变异，由于缺乏纠错机制，在病毒复制过程中产生的错误一代代积累，使病毒发生质的变异。目前国内随着水貂感染流感病例越来越多，流感在水貂中感染的情况已不容忽视。一方面，低致病性流感病毒感染后会造成幼貂存活率下降，高致病性禽流感病毒会造成高死亡率，经济损失严重[6]。另一方面，流感病毒长期对水貂感染适应后会增强对哺乳动物的适应性，对人类公共卫生安全造成较大威胁。有研究发现，禽源H9N2亚型流感病毒在水貂群传播过程中已获得Q226L 的突变，使得该病毒易与哺乳动物上呼吸道唾液酸受体结合，更容易感染人类[7]。而且，H5亚型流感病毒的T160A 突变也是禽流感病毒适应哺乳动物的突变[8]。

本次养殖场样品检测到的流感病毒HA 和NA 遗传进化分析显示均属于Y280-like 亚系，与近年其他省份禽源H9N2亚型流感病毒检测结果一致[9-10]。提示本次水貂感染为禽源流感病毒感染所致。因此，应加强水貂中流感病毒的监测和防控，尽快建立水貂流感病毒的监测机制，提高养殖户的生物安全意识。