一株羊源A 型产气荚膜梭菌的分离及初步鉴定

姚春阳 李通 孟卫芹 王金良

（1，山东省滨州畜牧兽医研究院 256600；2，青岛农业大学动物医学院 266109）

产气荚膜梭菌又称为魏氏梭菌，其广泛分布于自然界中，多存在于食物、饲料、粪便、土壤及人、畜肠道中[1]。产气荚膜梭菌是引起人和动物疾病的重要病原体之一，该菌为厌氧革兰氏阳性菌，镜检呈细直杆状，两端钝圆，芽孢可以在114℃的高温下存活1～4h。随着羊养殖产业的大规模发展，各地都出现了膘情较好的青年羊产气荚膜梭菌致死病例，该病发病急，死亡快，以肠道出血为主要症状，给羊养殖行业造成巨大的损失。引起羊产气荚膜梭菌病的原因很多，当动物经历长途运输到达一个新的环境，或是秋、冬、初春气候骤变而引起体质下降等应激因素都会引起疾病[2]。一般情况下，由A 型产气荚膜梭菌引起的动物死亡是毫无征兆的，死亡速度非常快，给诊断造成很大的困难，只有结合实验室诊断和流行特点来做判断[3]。本文用传统微生物学分离和分子生物学方法对山东某羊场中患病羊病料进行细菌分离鉴定，并对分离出的细菌进行分型，旨在为该羊场产气荚膜梭菌的治疗提供实验室检测的数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料

山东省某羊场的疑似产气荚膜梭菌感染患病羊。

1.1.2 试剂

液体硫乙醇酸盐培养基、卵黄琼脂培养基、绵阳血平皿为青岛海博生物技术有限公司产品；革兰氏染色液购自广东环凯微生物科技有限公司；厌氧培养袋为日本三菱（MGC）产品；细菌DNA 提取试剂盒及Taq DNA 聚合酶预混液购自北京百泰克生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病料的采集

采样前使用75%酒精对羊尸体进行消毒处理，使用手术刀切开腹壁，将手术刀经火焰灭菌切开腹膜，使用无菌注射器吸取腹水并做好标记，收集完成置于冷藏并立即送往实验室进行细菌的分离培养。

1.2.2 细菌分离

超净台内取腹水样品加入灭菌1.5ml 离心管中，使用灭菌接种环蘸取样品后分别在血平皿进行三区划线，将平板放入厌氧培养罐中加入厌氧袋于42℃培养24h 后观察细菌分离情况，并对分离菌进行革兰氏染色镜检，对疑似菌落接种卵黄琼脂平板42℃厌氧罐培养24h 后观察。

1.2.3 产气荚膜梭菌的PCR 鉴定

1.2.3.1 模版的制备

挑取单菌落接种于覆盖有5mm 厚液体石蜡经高温灭菌的硫乙醇酸盐液体培养基，于42℃培养24h，取细菌培养物1.5ml，使 用DNA 提 取试剂盒提取基因组DNA存于-20℃保存备用。

1.2.3.2 产气荚膜梭菌的PCR 鉴定引物

根据鲍长磊[6]等设计的产气荚膜梭菌鉴定引物对分离菌进行PCR扩增。毒素预期扩增片段大小为325bp、毒素预期扩增片段大小为236bp、毒素预期扩增片段大小为584bp、毒素预期扩增片段大小为443bp，并由安徽通用生物有限公司合成。

1.2.3.3 产气荚膜梭菌PCR 分型

PCR反应体系25μl：2XTaq Master Mix 12.5μl、无 菌ddH2O 6.5μl、上下游引物各1μl、模板4μl。PCR 反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，（毒素51℃，ε 毒素49℃，ι 毒素44℃）退火30s，72℃延伸40s，进行30 循环；72℃进行终延伸7min；4℃保存。取PCR 产物5μl 进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪拍照保存。

2 结果

2.1 细菌分离

经42℃培养24h 后在绵羊血平板上形成淡灰色、圆形、光滑、隆起的有双层溶血环菌落，其内环透明、完全溶血，外环淡绿、不完全溶血（图1）。革兰氏染色为革兰氏阳性两端钝圆的大杆菌（图2）。挑取单菌落在卵黄琼脂板上形成圆形、灰白色、表面光滑湿润、微凸、边缘整齐的菌落，在菌落周围培养基中形成明显的不溶性、不透明、白色的沉淀（图3）。

图2 产气荚膜梭菌革兰氏染色

图3 产气荚膜梭菌卵黄琼脂培养

2.2 产气荚膜梭菌的分型PCR 鉴定

PCR 鉴定结果显示，在325bp 位置出现目的条带（图4）其他无目的条带，证明为A 型产气荚膜梭菌。

图4 A 型产气荚膜梭菌毒素基因PCR

3 讨论

产气荚膜梭菌可引起多种人兽共患传染病，临床症状不明显，易引起死亡，已成为危害人类及养殖业的重要疾病之一。产气荚膜梭菌是感染牛、绵羊最常见的病原微生物之一，该菌产生的毒素数目多，致病力强。传统分型方法根据所产生的毒素、毒素、毒素、毒素将其分为5 个毒素型，即A 型(产毒素)、B 型(产毒素)、C 型（产毒素）、D 型(产毒素)、E 型(产毒素)[4]。产气荚膜梭菌所分泌的外毒素是其主要致病因子[5]，多作用于肠道，造成感染动物的急性死亡，其中A 型产气荚膜梭菌易引起气性坏疽和食物中毒[6]。

治疗羊产气荚膜梭菌的理论上使用抗生素进行抗菌治疗，但很多患病羊常没有任何临床症状，突然倒地死亡，或处于急性期的患病羊来不及治疗，在较短时间内死亡。因此，防治此病，预防免疫变得十分重要。产气荚膜梭菌病明显的症状是患病动物死亡后腹部膨胀，这是由于细菌产气所导致。预防该病主要是加强平时的饲养管理，注意气温突变对动物带来的影响，发现病羊要立即转移至地势高、干燥的草地上进行放牧，如果条件允许可采取转场[7,8]。为了有效预防羊梭菌病的发生，在做好羊三联四防疫苗免疫的同时，可适当加强羊群中药保健，羊场环境消毒等综合防控措施。