天津地区牛衣原体流行病学调查

朱雅宁 石瑜 （天津市动物疫病预防控制中心 300402）

天津地区牛衣原体流行病学调查

朱雅宁 石瑜 （天津市动物疫病预防控制中心 300402）

鉴于天津地区牛衣原体病已广泛存在，给养殖业带来巨大的经济损失，为摸清天津地区牛衣原体流行情况，采集了天津市4个区县10个养殖场 （户）的样品进行血清学和分子生物学检测，初步了解天津地区牛衣原体病的流行现状，调查表明：天津各地区均存在不同程度的牛衣原体感染，而且衣原体阳性率高低与家畜饲养量有密切相关性；公牛的血清样品检测出阳性，应该重视种公畜精液污染衣原体问题。这些可为天津市研究制定牛衣原体病的预防提供技术依据。

牛衣原体病；血清学方法；分子生物学方法；流行病学；调查；天津地区

牛衣原体病是由鹦鹉热衣原体感染牛引起的一种具有广泛症候群的接触性传染病，可以引起妊娠母牛流产、公牛精囊炎综合征、犊牛支气管肺炎、肠炎等症状。由于本病给奶牛场造成的不仅是胎儿死亡，而且更严重的是产奶量大大降低，造成饲料、人力、医药等巨大浪费，给畜牧业带来巨大的经济损失，所以牛衣原体病的危害应引起足够重视。

为了掌握天津地区牛衣原体流行特点，2012～2014年期间，我们通过对天津地区4个区县的不同养殖环境的奶牛采集样品进行检测，初步了解天津地区牛奶衣原体病的流行现状，为顺利开展牛衣原体病综合防控技术示范工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品

共采集牛血清样品1887份，精液和棉拭子样品270份。分别采自天津宝坻、武清、北辰、蓟县4个区县的10个养殖场 （户）。见表1和表2。

1.2 诊断试剂

（1）衣原体间接凝集诊断试剂盒 （IHA）：购自中国农业科学院兰州兽医研究所，抗原批号130524、140524，稀释液130524、140524，阳性血清 130403、140403，阴性血清130524、 140524。

（2）鹦鹉热衣原体 （ACP）核酸检测试剂盒：购自北京索奥生物医药科技有限公司，批号为20130615、20140615。

1.3 方法

表1 牛血清样品

表2 牛精液和棉拭子样品

1.3.1 间接血凝试验

（1）衣原体IHA抗原，使用前摇匀。

（2）每孔加入75μL稀释液。

（3）在第一孔加入25μL被检血清，呈4倍递增稀释3孔 （1∶4～1∶16）， 第 3 孔弃去 25μL。 同一板上同时设阳性、阴性和空白对照各2孔 （2个阳性、2个阴性，空白2孔）。

（4）每孔加入稀释的抗原25μL，置微型振荡器上震荡2min，封口，在37℃作用2h后判定结果。

判定标准：在对照孔成立的条件下，观察各待检血清孔，被检血清1∶16孔为++及以上凝集者为阳性，1∶4孔为++及以下者为阴性。

1.3.2 荧光PCR法

用鹦鹉热衣原体 （ACP）核酸检测试剂盒 （PCR-荧光探针法）。

（1） DNA提取

标本预处理

①精液样品：将精液充分混匀，取0.5mL转至1.5mL干净离心管，加入等体积4%NaOH，充分混匀，室温放置10min，13000rpm离心5min，弃上清，保留沉淀。

②棉拭子样品：取1mL生理盐水加入5mL离心管，充分洗涤棉拭子，将洗涤液转至1.5mL干净离心管中，13000rpm离心5min，弃上清，保留沉淀。

DNA提取：向上述标本中加入50μL核酸提取液月充分混匀，100℃裂解10min。13000rpm离心 3min，取上清液4μL做PCR反应。

阴性质控品：取50μL阴性质控品加入50μL核酸提取液月，充分震荡。然后100℃裂解10min，然后13000rpm离心3min，取上清液4μL做PCR反应。

ACP-阳性质控品：直接取4μL进行PCR扩增。或按照PCR扩增介绍方法进行定量分析。

（2） PCR扩增

从试剂盒中取出ACP-PCR MIX、Taq酶系，室温融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。

设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+4管阳性对照），每个测试反应体系配制为：ACP-PCR MIX 24 μL， Taq 酶系 2μL。

（3）结果判定

如果Ct值＜38，判定为阳性。

如果38＜Ct值＜40，为可疑，建议重新检测，重新检测若38＜Ct值＜40判为阳性，否则为阴性。

如果Ct值≥40，判定为阴性。

2 结果

2.1 不同区县牛流产衣原体检测结果

利用IHA方法对采集的1887份牛血清样品进行检测。共检测出93份阳性样品，平均抗体阳性率为4.93%。其中宝坻、武清、北辰、蓟县的抗体阳性率分别5.66%、4.15%、5.18%、6.00% （结果见表3）。

表3 不同区县牛血清抗体检测结果

2.2 不同生长阶段牛血清抗体检测结果

利用IHA方法对采集的奶牛、犊牛、公牛的1887份血清样品进行检测，共检测出93份阳性样品，平均抗体阳性率为4.93%。其中奶牛、犊牛、公牛的抗体阳性率分别为5.74%、3.64%、4.00% （结果见表4）。

表4 牛血清抗体检测结果

2.3 牛病原学样品检测结果

利用荧光PCR方法对采集的270份样品进行检测，共检测出12份阳性样品，平均阳性率为4.44%，其中奶牛阴道拭子样品的阳性率较高，为4.55%，公牛精液样品的阳性率较低，为4.00% （结果见表5）。

表5 牛精液病原学检测结果

3 讨论与结论

（1）本次利用IHA方法对天津4个区县的部分牛场进行衣原体血清学和病原学监测，抗体平均阳性检出率为4.93%，病原学阳性率为4.44%。结果表明，天津各地区均存在不同程度的牛衣原体感染，而且衣原体阳性率高低与家畜饲养量有密切相关性，饲养密度大阳性率高。

（2）本次调查发现，抗体阳性率较高的是奶牛和公牛的血清样品，分别为5.74%、4.00%。对应的抗原阳性率较高的是母牛阴道拭子样品，为4.55%。病原学检测中，公牛精液的阳性率稍低于奶牛阴道拭子的阳性率。因此，公牛精液和母牛在本病传播中起关键作用，尤其是公牛的精液污染衣原体在传播中起主要作用，母牛感染后又通过阴道向体外排菌，感染犊牛群和饲养人员，这提示除了重视对母畜的防控外，还应该重视种公畜精液污染衣原体问题。及时阻断衣原体通过精液垂直传播衣原体，造成怀孕母畜群流产和死胎的危险。

（3）分析原因，衣原体病的流行主要有以下几方面：第一，对衣原体的危害性认识不足，没有采取相应的综合防治措施，导致衣原体病在家畜中大面积蔓延；第二，天津地区养殖业迅速发展，市场交易、运输频繁，从而加速衣原体病的扩散。通过实地调查，更进一步表明，养殖场应对衣原体病引起足够的重视。具体建议措施如下：第一，建立封闭的饲养系统，建立严格的卫生消毒制度。严格把好工作区大门通道消毒、圈舍消毒、场区环境消毒的质量，以有效控制发生衣原体接触传染的机会。对病死畜要集中无害化处理，同时用火碱等消毒剂进行严格消毒；第二，建立科学合理的免疫程序，加强衣原体病的日常监测。对确诊感染衣原体的种畜予以淘汰，未感染的应及时接种衣原体灭活疫苗；第三，选择药物预防和治疗。

朱雅宁 （1982.3-），女，大学本科，兽医师，主要从事实验室检测工作。