一例野猪感染猪瘟病例的实验室诊断

华莹 王慧 李涛 王开功 文明 周碧君 程振涛

（1，贵州省动物疫病预防控制中心 550008；2，贵州大学动物科学学院 550025；3，贵州省动物疫病研究室 550025）

一例野猪感染猪瘟病例的实验室诊断

华莹1王慧1李涛1王开功2，3文明2，3周碧君2，3程振涛2，3

（1，贵州省动物疫病预防控制中心 550008；2，贵州大学动物科学学院 550025；3，贵州省动物疫病研究室 550025）

采集两头临床症状疑似猪瘟的病死野猪内脏组织，应用分子生物学和细菌学方法进行实验室诊断。经细菌分离鉴定，未发现典型致病菌感染；经PCR和荧光定量RT-PCR检测，确诊该病例为猪瘟病毒感染所致。

野猪；猪瘟；实验室诊断；PCR；荧光定量RTPCR

猪瘟（Classical swine fever，CSF） 是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种急性、热性和高度接触性传染病，被世界动物卫生组织列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病[1-3]。该病在世界各地均有不同程度流行，典型特征为发病急、高热稽留，全身广泛性出血，肠纽扣状溃疡，脾脏边缘梗死和肾密集点状出血[4，5]。

2014年11月，贵州省某养猪场所饲野猪陆续出现死亡病例。病猪出现精神沉郁、厌食、消瘦，结膜潮红，耳、四肢及腹下皮肤呈现不同程度的紫红色。解剖病死野猪，可见全身性出血，肺脏水肿淤血，脾脏边缘有出血性梗死灶，肾脏肿大出血及全身淋巴结肿大出血。为确诊病因，对两头病死野猪内脏组织进行了分子生物学和细菌学检测，最终确诊为猪瘟病毒感染。现将病例诊断情况介绍如下，以期为预控疫病流行暴发提供技术支持和诊断参考。

1 材料与方法

1.1 材料

病料采自贵州省某养猪场两头病死野猪病变内脏组织（脾脏、肾脏及淋巴结）；猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪瘟病毒（CSFV）RNA提取试剂盒及普通RTPCR、荧光RT-PCR扩增试剂盒，均购自北京世纪元亨有限公司；细菌分离培养基为实验室制备保存。

1.2 细菌检测

无菌采取病死野猪肝脏、脾脏、心脏进行涂片、染色、镜检。同时无菌操作划线接种血清琼脂平板培养基，37℃恒温培养箱培养24h后观察其特征。

1.3 PRRSV、CSFV核酸检测

1.3.1 总RNA提取

取病死野猪的脾脏、肾脏及淋巴结无菌研磨成组织匀浆液，以13000rpm离心3min。取上清液，按照世纪元亨试剂盒说明书提取病料总RNA。以针对PRRSV和CSFV的世纪元亨普通RT-PCR和荧光RT-PCR扩增试剂盒进行定性和实时定量扩增。

1.3.2 PRRSV、CSFV特异性扩增

取提取的病料总RNA，分别以针对PRRSV和CSFV的世纪元亨普通RT-PCR扩增试剂盒进行特异性扩增，扩增产物进行凝胶电泳鉴定。

1.3.3 CSFV实时定量扩增

取提取的病料总RNA，以针对CSFV的世纪元亨荧光RT-PCR扩增试剂盒进行实时定量扩增。

2 结果

2.1 细菌分离培养结果

无菌采取病死野猪肝脏、脾脏、心脏制成涂片，经瑞氏染色镜检，未见典型的致病菌。

2.2 PRRSV、CSFV特异性扩增结果

以世纪元亨PRRSV和CSFV普通RT-PCR核酸检测试剂盒对提取的病料总RNA进行特异性扩增，扩增产物进行凝胶电泳鉴定，结果见图1、图2：

图1 PRRSV特异性RT-PCR扩增结果

由图1可知，从病死野猪组织所提基因组RNA中均未出现PRRSV特异性扩增条带；由图2可知，从病死野猪组织所提基因组RNA中有5份出现大小为235bp左右的CFSV特异性扩增条带。初步表明病死野猪感染了CSF，而未感染PRRS。

图2 CSFV特异性RT-PCR扩增结果

2.3 CSFV实时定量检测结果

以世纪元亨CSFV通用荧光RT-PCR核酸检测试剂盒对提取的病料总RNA进行实时定量扩增，结果见图3。

图3 CSF实时荧光RT-PCR扩增结果

由图3可知，从病死猪组织所提基因组RNA中有5份出现特异性扩增曲线。

图4 CSFV实时定量检测结果

从图4中可见，CT值在21.4415～26.9073范围内。根据说明书结果判定CT值＜30且出现特异性扩增曲线，为CSF阳性，初步判定该病死猪为PRRS感染所致。

3 讨论

猪瘟是我国四大动物疫病之一，至今已流行80多年，是发生最多、危害最大、流行最广的传染病[6-8]。据资料统计，近年来我国因病死亡的猪占饲养总数的8～10%，其中约30%是由猪瘟致死[9]，而且猪瘟的流行与发病特点发生了很大变化，在临床表现上也更加复杂，在病理剖检上也常常不同于典型猪瘟的病理变化，给猪瘟的临床诊断带来了很大困难[10]。同时CSF剖检病变与PRRS等疾病极其相似，这给CSF的临床诊断造成了较大困难[11]。而试验证明应用荧光RT-PCR方法进行CSFV检测，同时结合临床症状可作出快速诊断[12，13]。荧光定量PCR具有操作简单、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，通过此方法能够实现定量，通过定量可以对感染状况进行初步判断，因而得到广泛应用[14-16]。在国内外该技术也已用于猪瘟病毒的定量检测[17-19]。

本实验采用分子生物学和细菌学方法对临床表现精神沉郁、消瘦、四肢及腹下皮肤呈现不同程度的紫红色等症状病死野猪进行了病因确定性诊断。本次诊断依照农业部有关规定，对临床疑似CSF病例进行了实施RT-PCR及荧光RTPCR双重检测实验室诊断，最终确诊该病例为CSF感染所致。

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华莹（1982-），女，汉族，贵州省贵阳市人，甘肃农业大学预防兽医学在读博士，主要从事动物疫病病原学研究。