抑制素α-亚基成熟区基因在大肠杆菌中的原核表达

薛琳琳（黑龙江省双城市黑龙江职业学院 150111）

抑制素α-亚基成熟区基因在大肠杆菌中的原核表达

薛琳琳（黑龙江省双城市黑龙江职业学院 150111）

本试验成功获得抑制素α-亚基编码序列的克隆载体后，从阳性细菌中提取质粒，经SacI和XhoI酶切，回收354bp目的片段，与表达载体pET-32a连接，将构建好的pET32a（+）-INH-α原核表达质粒转化到受体菌E.coli BL21（DE3）中，经IPTG诱导后，Tricine-SDS-PAGP电泳鉴定，检测到仔鹅与东北白鹅抑制素-α成熟区基因的表达。

抑制素；α-亚基；原核表达；试验

1 材料与主要试剂

仔鹅与东北白鹅的抑制素α-亚基（INH-α）编码序列的克隆载体、BL21（DE3）大肠杆菌和表达载体pET-32a Vector，均由黑龙江八一农垦大学分子生物学实验室保存。

低分子量标准蛋白Marker：大连宝生物有限公司；T4 DNA Ligase：大连宝生物有限公司；IPTG、DMSO：大连宝生物有限公司；三羟甲基氨基甘氨酸（Tricine），Tris碱，SDS：鼎国试剂有限公司；甘油，巯基乙醇、PEG、DTT为国产分析纯试剂。

2 方法

2.1 仔鹅和东北白鹅抑制素α-亚基成熟区基因原核表达载体的构建

2.1.1 重组克隆载体的酶切消化

使用限制性内切酶SacI和XhoI同时双酶切重组克隆质粒pMD18-TSimple-INHα和pET-32a质粒，并回收目的片段。

2.1.2 酶切产物的连接

将目的片段与表达载体pET-32a连接。连接体系见表1。

表1 目的基因与质粒载体的连接反应体系

将连接产物转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，取100μl转化产物涂布在含Amp（60μg/ml）的LB平板上，倒置培养，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。挑取单个菌落（2～3mm直径）接种于含Amp（50μg/ml）的LB液体培养基中，37℃置于摇床（200rpm/min）培养过夜，试剂盒法提取质粒。

将所提取的质粒DNA在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外灯下观察结果，选取质粒进一步进行PCR扩增和限制性内切酶消化分离DNA片段鉴定。

2.1.3 重组质粒的鉴定

扩增体系按照表2质粒PCR体系操作，将重组质粒进行双酶切。将PCR扩增和双酶切鉴定正确的重组质粒送上海生物工程有限公司进行序列测定。

表2 质粒PCR扩增体系

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃后延伸10min。

2.2 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达

对表达菌株分别用不同浓度的IPTG（终浓度0.5、1、2、4、8mmol/L）和不同诱导时间（1、2、3、4、5h）进行表达条件的优化。

2.3 表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳（Trision-SDSPAGE）检测

鉴定为阳性的菌液，经IPTG3.5h诱导后，进行Trision-SDS-PAGE电泳[1，2]。

3 结果与讨论

（1）经PCR扩增和双酶切鉴定，如图1所示，结果在约354bp和5900bp处见到明显的条带，与预期目的带大小相符。

图1 酶切鉴定表达载体重组质粒pET32a-INH-α

（2）取超声波破碎处理的诱导菌液沉淀和上清进行Trision-SDS-PAGE分析。结果如图2，融合蛋白大部分以包涵体的形式存在，在32.8kDa位置有一明显符合预期大小的条带。

图2 包涵体的鉴定

（3）加入IPTG诱导1～5h后，经Trision-SDS-PAGE分析，通过Imagemaster totallab v1.11软件进行凝胶自动扫描分析，融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的28.96%。在约3.5h达到最大表达量，如图3。

图3 INH-α基因在大肠杆菌中的诱导表达

4 结论

构建了仔鹅和东北白鹅INH-α亚基成熟区cDNA的原核表达载体pET32a（+）-INH-α，为进一步进行鹅INH-α亚基的真核表达打下重要的理论基础、提供重要的参考数据。

将构建好的ET32a（+）-INH-α原核表达质粒转化到受体菌E.coli BL21（DE3）中，经IPTG诱导后，Tricine-SDSPAGP电泳鉴定，检测到INH-α外源基因的表达。而且，本研究构建的融合蛋白表达量很高（约占菌体总蛋白的30%），是一种较实用的原核表达系统。

[1]曹佐武.小分子肽的Tricine-SDS-PAGP分离方法.生物学通报[J].2003,38（3）:55-56.

[2]J Sambrook,DW Russell.Expression of cloned genes in E.coil using the bacteriophage T7 promoter[M].Molecular cloning,a laboratory Manual,third edition.2001,Cold Spring Harbor Laboratory Express,New York.Pp15.20-15.24.

薛琳琳（1980-），女，硕士，副教授，主要从事家禽饲养繁育及动物解剖生理教学及科研工作。