水貂支气管败血波氏杆菌的分离鉴定

刘世霞（山东省沂水县马站畜牧兽医工作站 276403）

水貂支气管败血波氏杆菌的分离鉴定

刘世霞（山东省沂水县马站畜牧兽医工作站 276403）

支气管败血波氏杆菌是广泛感染多种哺乳动物，有时也感染人的一种常在病原菌。该菌属于波氏杆菌属，借其粘附素和毒素对宿主致病，引起感染动物的呼吸道疾病，并协同其他病原菌形成严重的肺部混合感染，备受人们的广泛关注。

1 试验材料与仪器

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源

山东省沂水县马站镇刘庄水貂养殖场。

1.1.2 培养基

胰蛋白胨大豆琼脂（由北京中海生物科技有限公司生产），肉汤琼脂（由北京陆桥技术有限责任公司生产），血液培养基、普通琼脂平板、麦康凯琼脂（青岛高科园海博生物技术有限公司），琼脂粉（天津市光复精细化工研究所）。

1.1.3 相关试剂

波氏菌属细菌生化编码鉴定管（购自上海土锋生物科技有限公司），快速革兰氏染色液试剂（购自济南百博生物技术股份有限公司）。

1.1.4 药敏试验纸片

药敏试纸片（杭州天和微生物试剂有限公司）。

1.1.5 试验动物

10日龄SPF鸡胚6枚，2日龄雏鸡6只，19～23g小白鼠6只，均由临沂大学预防兽医学实验室提供。

1.2 试验仪器和器材

1.2.1 试验仪器

DY04-13-44-00压力蒸汽灭菌器桶，SPX-250B-Z型生化培养箱，SW-WJ-LCU洁净工作台，恒温箱，照蛋器，SA3000PL光学显微镜，FT-XFC3孵化箱，电子天平，电热炉（中国龙口市先科仪器公司）。

1.2.2 玻璃器材

试管、培养皿、烧杯、量筒、250ml锥形瓶、300ml锥形瓶、玻璃棒、酒精灯。

2 试验方法

2.1 培养基的制备

培养基制备的基本方法：称量→溶解→分装→灭菌→备用。

2.1.1 麦康凯培养基的制备

用电子天平称取13.5g麦康凯琼脂，溶于盛有250ml蒸馏水的锥形瓶中，在电热炉上加热搅拌至完全溶解。取10个洗净烘干的培养皿，进行分装，每个培养皿倒入20ml麦康凯琼脂溶液。采用高压蒸汽灭菌法，在103.4kPa的蒸汽压下121℃加热20min对初步配置的麦康凯培养基进行灭菌，冷却备用。

2.1.2 半固体培养基的制备

用电子天平称取3.8gTSA琼脂，溶于盛有100ml蒸馏水的锥形瓶中，再向锥形瓶中加入0.5g的琼脂粉，在电热炉上加热搅拌至完全溶解。取10个洗净烘干的试管，进行分装，每个试管倒入5ml溶液，高压蒸汽灭菌，方法同上。

2.1.3 血液培养基的制备

用电子天平称取9.5gTSA琼脂，溶于盛有200ml蒸馏水的锥形瓶中，在电热炉上加热搅拌至完全溶解，高压灭菌后待用。取试验兔子，无菌心脏采血后立即注入装有玻璃珠的灭菌瓶中，缓慢摇动，进行脱纤维处理。取20ml脱纤无菌血倒入已溶解的TSA锥形瓶中。进行分装，每个培养皿倒入20ml加入了脱纤血的TSA溶液。避免污染，冷却待用。

2.1.4 肉汤培养基的制备

用电子天平称取1.5g肉汤琼脂，溶于盛有50ml蒸馏水的锥形瓶中，加热搅拌至完全溶解。分装，每个试管倒入5ml溶解的肉汤琼脂，高压蒸汽灭菌，备用。

2.1.5 普通琼脂培养基的制备

用电子天平称取13.5g普通琼脂粉，溶于盛有200ml蒸馏水的锥形瓶中，在电热炉上边加热边搅拌至完全溶解。取洗净烘干的培养皿，进行分装，每个培养皿倒入20ml普通琼脂溶液。采用高压蒸汽灭菌法，在103.4kPa的蒸汽压下121℃加热20min对初步配置的普通琼脂培养基进行灭菌，冷却备用。

2.2 涂片和染色

接种环灭菌后无菌操作取水貂气管环内容物，置于2ml营养肉汤试管中，37℃生化培养箱中增菌24h。取无菌洁净的载玻片一张，接种环火焰灭菌后取2环营养肉汤培养液，制成直径为1cm的涂片，经火焰干燥固定，进行革兰氏染色，显微镜油镜镜检。

2.3 分离培养和观察

无菌操作取细菌肉汤培养液，采用平板分区划线法接种至血平板，置于37℃恒温箱培育24h，观察菌落形态。挑取单个可疑菌落接种于麦康凯培养基，至于37℃生化培养箱培养36h，观察结果。

2.4 运动性观察

在洁净工作台上用灭菌的接种针分别挑取血液培养基可疑菌落，垂直穿入半固体培养基中心接近试管底部，然后迅速沿原路退出，灭菌接种针，将试管至于37℃生化培养箱中培养24h，观察结果。

2.5 生化试验检测

从血液培养基中挑取可疑单个菌落，接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、过氧化氢酶、氧化酶、枸橼酸盐、甘露醇、氰基质、还原硝酸盐、尿素酶、木糖，山梨醇，硫化氢，维培二氏试验（VP试验），甲基红（MR）微量生化反应试管，至于37℃生化培养箱培养24h后观察生化反应结果。

2.6 动物致病性试验

2.6.1 鸡胚接种

取6个10日龄鸡胚，随机分成试验组和对照组，每组3只。用照蛋器照蛋，用铅笔划出气室和接种的位置，应避开鸡胚大血管，远离胚胎侧气室边缘。试验组每个鸡胚尿囊腔接种菌悬浓度为4×1010CFU/ml的细菌肉汤培养液0.3ml，对照组每只注射0.3ml灭菌的生理盐水，完成后用融化的蜡封住接种孔，置于恒温孵化箱中，孵化3d。

2.6.2 雏鸡接种

取6个2日龄雏鸡随机分成试验组和对照组。试验组的雏鸡每只腹腔注射菌悬浓度为4×1010CFU/ml的细菌肉汤培养液0.5ml；对照组的每只雏鸡仅腹腔注射0.5ml的无菌肉汤培养液。

2.6.3 小白鼠接种试验

取6只20g左右的小白鼠随机分成试验组和对照组。试验组小白鼠每只腹腔注射菌悬浓度为4×1010CFU/ml的细菌肉汤培养液0.5ml；对照组的每只小白鼠腹腔注射0.5ml的无菌肉汤培养液。

2.7 药物敏感性试验

按照World Health Organization推荐的Kirby-Bauer纸片扩散法（K-B法）对细菌进行的敏感性试验。以涂布法接种分离的菌株，采用无菌吸管吸取24h细菌肉汤培养液0.2ml，滴在普通琼脂平板表面的中央位置，用无菌涂棒将细菌悬液沿各个方向涂布均匀，室温下放置5min，使细菌液充分吸附培养基。取庆大霉素、青霉素、氟哌酸、四环素、万古霉素、卡那霉素、克林霉素、左氧氟沙星、丁胺卡那霉素、乙酰甲喹、环丙沙星药敏纸片贴在培养基上，培养箱中培养24h后，测量抑菌圈直径。药物敏感性试验结果的判断标准，按LS 2001年版的规定执行。

3 试验结果及分析

3.1 临床症状与病理剖检诊断结果

病貂表现食欲减退，甚至废绝，流鼻液，咳嗽的呼吸道症状。解剖后可见呼吸道有脓性粘液，呈淡黄色，肺脏表面有大小不一的化脓灶，肺水肿出血淤血。符合支气管败血波氏杆菌的致病特征。

3.2 涂片染色观察结果

经显微镜镜检，分离菌为革兰氏阴性两端钝圆的杆菌，短小，少数成对存在，大多单在分散，有的成对存在，未发现芽孢。符合支气管败血波氏杆菌的形态特征。

3.3 分离培养的结果

在普通琼脂平板培养基上培养24h，形成灰白色、湿润、边缘整齐、沿划线生长的光滑型菌落，中等大小；在麦康凯培养基上菌落未变红，形成灰白色、微隆起、圆形、致密、光滑湿润的小菌落；在兔血液培养基上培养24h，菌落生长较旺盛，呈β溶血，形成圆形、隆起、光滑、灰色的中等大菌落。

3.4 运动性检测结果

分离菌沿穿刺线向四周生长，呈试管刷状，表明菌体具有运动能力。

3.5 生化试验的结果

分离菌不发酵任何糖类，不分解碳水化合物，MR、VP和吲哚试验阴性，氧化酶、触酶阳性，尿酶阳性，符合支气管败血波氏杆菌的生化试验特性。

3.6 鸡胚接种结果

试验组鸡胚孵化箱孵化3d后全部死亡，健康组和对照组无异常。对死亡鸡胚进行剖检，观察符合支气管败血波氏杆菌的致病特征。

3.7 雏鸡接种结果

试验组雏鸡全部死亡，对试验组进行剖检观察，可见肠道粘膜出血，小肠有臌气，肾、脾均有出血点，皮下有粘稠的红色液体渗出。对照组雏鸡健康存活，均无异常变化。符合支气管败血波氏杆菌的致病特征。

3.8 小白鼠接种结果

试验组小白鼠全部死亡，对试验组小鼠进行剖检观察，可见肠道粘膜出血，小肠有臌气，肾、脾均有出血点，皮下有粘稠的红色液体渗出。对照组小白鼠健康存活，均无异常变化。符合支气管败血波氏杆菌的致病特征。

3.9 药敏试验结果

分离菌对于庆大霉素、丁胺卡那霉素、环丙沙星高度敏感，抑菌效果良好；对于氟哌酸、四环素、左氧氟沙星中度敏感；而对青霉素、万古霉素、克林霉素、菌痢净的敏感性较差。临床用药应优先考虑庆大霉素、丁胺卡那霉素、环丙沙星3种药物。

4 讨论

（1）波氏杆菌病的发生与环境因素相关性很大，因此，为了防控支气管败血波氏杆菌在水貂群中感染，首先必须加强貂群饲养管理，做好卫生清理工作，定期消毒，提高水貂对病原体的抵抗力。

（2）发病时可选用药物治疗，通过药敏试验，庆大霉素、丁胺卡那霉素、环丙沙星药物效果良好，但临床用药时应注意轮换用药和联合用药，避免获得性耐药性的产生。

（3）由于波氏杆菌很容易发生菌相变异，麦康凯培养基初次培养24h产生的光滑型菌落，再经生化培养箱培养24h后，部分光滑型菌落变为粗糙型菌落。

（4）建立无水貂支气管败血性波氏杆菌的貂群。引种和合群前一定要做好病原的检测，水貂一旦发病应及时妥善处