植物源杀虫剂发展新方向

叶 萱 编译

(上海市农药研究所，上海 200032)

植物通过基础代谢作用能合成许多化学物质，其中大部分是植物生长、发育和繁殖等重要功能所需的物质，但有一小部分为次生化合物途径的底物。在这些化合物中，一些类别在适应环境和防御机制中具有一定作用而值得关注：蛋白质化合物和次级代谢物。植物会因多种因素产生这两类物质。作为植物构成物质，它们能够降低植物组织的适口性或使取食生物中毒；作为诱导性物质，在植物组织遭受危害时，植物合成这些物质。从进化的角度看，这些化合物与植物成功抵御昆虫危害的保护机制有紧密的关系。因此，这些化合物对许多害物有毒，是防治害物潜在的方法。

人类使用植物和植物产品防治害虫和微生物的确切时间已无法知晓，但与农业生产有久远的关系。最初简单、直接地应用植物防治害物，随着知识的扩展和经历不同的文明，在19世纪前，开始应用植物提取物为农药。同时期，对一些植物次生化合物进行了鉴定和表征，近而用于趋避剂和杀生剂，主要为烟碱和其同分异构体假木贼碱等生物碱。但是其他两个重要类别化合物改变了天然化合物的合成之路，开始了天然化合物启发的农药研发之路。这两类为鱼藤酮和除虫菊酯。

一直到二战，植物源农药被广泛用于农业害虫的防治。然而，在20世纪30年代末，植物源农药被合成有机化合物取代，这些物质持效期长，选择性小，如六六六(C6H6Cl6)、滴滴涕(C14H9Cl5)、艾氏剂(C12H8Cl6)、狄氏剂(C12H8Cl6O)和氯丹(C10H6Cl8)。此后有机氯农药在农业中一直占据主导地位，直到20世纪70年代农场工人急性中毒、地下水污染、野生动物的死亡、传粉媒介受到影响和昆虫抗性的产生等许多事件的出现，引起人们对农药选择性和在环境中的持效性的关注。

自此以后，全球对农药对人畜健康和环境影响的关注不断增加对合成杀虫剂使用的行政管理和和限制。目前是重新评估植物杀虫剂的恰好时机，植物源杀虫剂受到科学巨大进步的影响，在过去20多年中有关植物提取物防治节肢动物的文献量大量增加。本文对使用最广和最有发展前景的植物源杀虫剂进行收集和分类。介绍了一些商业化防治害虫的植物化学物质类别，也讨论了作为植物部分防御机制的蛋白质化合物。虽然对这些蛋白质化合物进行了大量研究，但仍没有有效地应用于田间。

1 次级代谢产物

次级代谢产物可作为趋避剂、取食抑制剂和毒物有效防治植食性昆虫。这类植物化学物质被广泛用于作物保护直到20世纪40年代有机氯农药的登场。现在这些物质主要用于有机农业中，但仍是生物勘探新分子的重要途径。事实上，已对许多植物品种的杀虫特性进行了筛选，文献也报道了大量的具有生物活性的化合物，然而，其中很少的物质被适当地测试，现在只有4个有效商业化的植物源产品：除虫菊酯、鱼藤酮、印楝素和精油。表1列出了过去10年商业化的主要活性物质。自此以后，全球市场没有发生大的变化，部分原因是为天然产品申请专利有很大的难度。

从经济角度看，除虫菊酯代表最重要一类商业化植物源杀虫剂。通常从除虫菊(Chrysanthemum cinerariaefolium)的花提取，此植物的活性化合物是1类结构相似的酯。除虫菊酯I含量最大，也是杀虫活性最高的成分(图1A)。已知除虫菊酯具有击倒作用，作用于昆虫后，昆虫先过度兴奋，而后麻痹死亡。这是由于除虫菊酯作用后，昆虫的神经细胞膜内的钠离子通道打开而引发的症状。纯除虫菊酯对哺乳动物具有中等毒性(LD50～350～500 mg/kg)，但商业化产品(有效成分约25%)毒性低(约1 500 mg/kg)。然而，除虫菊酯特别不稳定，在紫外光下极易分解。一些研究表明在田间除虫菊脂的半衰期约为2 h，这大大限制了其防治农业害虫的应用。尽管如此，除虫菊酯仍然列于植物源杀虫剂的首位，在全球销售用于家庭园艺和花卉植物栽培中的害虫管理。

表1 商业化植物源杀虫剂中的主要次生化合物和官能团

图1 A)除虫菊酯I的三维结构和分子式，B)鱼藤酮的三维结构和分子式

鱼藤酮为热带豆科植物根或根茎产生的异黄酮类物质(图1B)。它们是毒性极高的次生化合物，抑制昆虫的食欲，致其数小时或数日内死亡。在67种以上豆科植物中这些物质的含量丰富，且由其开发了一个广谱非内吸杀虫剂，用于防治蚜虫、蓟马和刺吸式害虫。此化合物的作用机制不同于除虫菊酯，其作用于线粒体，阻断了从复合体I铁硫中心到辅酶Q的电子转移，阻碍了能量的(ATP)生成。鱼藤酮作为杀虫剂，是胃毒剂，通过昆虫的摄入才能起作用。此外，鱼藤酮的降解非常快，但持效期比除虫菊酯长，在空气和日光中为3～4 d。在近20年鱼藤酮商业化用于有机农业，然而，在近年，一些研究表明急性暴露于大鼠，可产生相似于帕金森的大脑损伤，这使有关许多天然产品使用的生物安全标准的建立减慢了。

另一次生化合物类别印楝素是柠檬苦素类物。其分子机构复杂，作用谱广，对550种昆虫有生物活性，主要为鞘翅目(甲壳虫、象甲)、网翅目(蜚蠊)、双翅目(蝇)、半翅目(臭虫)、同翅目(蚜虫、蜂和蚂蚁)、等翅目(白蚁)、鳞翅目(蛾类)、直翅目(蝗虫)、隐翅目(蚤)和缨尾目(蓟马)。此物质根据印楝树命名，在印度几个世纪用于抗菌剂和杀虫剂。

商业印楝素为胃毒剂，但高剂量使用时，也常会有触杀毒性。报道直接用于地面或注射入植物茎杆，也有内吸作用。不过，印楝素作用特性会根据昆虫的发育阶段、季节和天气条件的不同发生变化。在暴露后，印楝素可能立即抑制昆虫的食欲，以及具有内吸中毒和抑制蜕皮活性；也可延迟甚至阻碍昆虫胚后发育，出现产卵缺陷，不育，抑制酶和几丁质合成。目前，有2类商业化的植物源农药印楝素：冷压种子直接得到的油对软体昆虫有效；具有较高活性的用水醇提取的种子提取物，三萜类印楝素A为活性物质。印楝素有许多类似物，而印楝素A和其他少量的化合物的复杂混合物共同起作用，且难以提取。虽然对哺乳动物(LD50＞5 000 mg/kg)、鱼和传粉昆虫无毒，印楝素对天敌的影响变化很大，需要特别注意。一些田间试验表明印楝素在日光照射下持效期约20 h，对于某些作物，印楝素可能具有内吸作用，在田间的持效期增加。

由于详尽登记程序的豁免，原材料丰富且容易获得，活性成分的成本相对低等原因，最近许多公司在商业开发精油杀虫剂。精油是通过水蒸馏芳香植物叶片、花或果实获得的一小部分物质。精油一般是由50多种化合物(常见的化合物见图2)组成的复杂混合物，可能含有单帖、倍半帖烯、乙醇、酮、醛和酚，通常约12个主要化合物的含量占90%。从结构来看，帖烯常见的特征为其烃骨架，此结构赋予了主要与蛋白失活和抑制酶活性的疏水性，典型的例子为乙酰胆碱酯酶。

精油防治昆虫的活性直接与其化学成分有关，其次与作物种植和环境条件有关。这些情况使标准化大规模生产和实验室试验的再现性相当难。然而在20世纪90年代人们对精油的兴趣日益高涨，大量的试验表明其对许多害虫具有熏蒸和触杀活性。虽然天敌经直接接触对精油敏感，但捕食者和寄生者经残留接触不会有中毒风险。

图2 商业化杀虫剂精油的最主要活性化合物的三维结构

2 蛋白质化合物

2.1 源于植物的杀虫肽

2.1.1 环肽

对源于植物的杀虫肽类物质，人们对其中的环肽很是关注。这类头尾相连的环肽在堇菜科、茜草科和葫芦科植物中广泛发现。根据环肽骨架的loop 5中顺式脯氨酸模体的存在(Möbius)或缺少(bracelet),环肽被分为2类：即Möbius和bracelet。从结构上看，环肽一般由27～37个氨基酸残基形成扭曲的三链β折叠，环骨架和称为半胱氨酸结(CCK)中的3个二硫键起稳定作用(图3A)。在半胱氨酸结中由Cys1-Cys4和Cys2-Cys5形成的二硫键以及相连的骨架片段，稳定嵌入环，而第3个Cys3-Cys6二硫键穿过此环(图3A)。此独特的结构特征不仅可用于区分环肽和从细菌、植物和动物中发现的其他圆型蛋白，而且使其额外稳定，不易被酶降解，不受温度变化和化学物质的影响。由于这些特性，已评估环肽的抗细菌、杀线虫和杀虫的生物功能。

害虫防治受到极大的社会和经济关注。为了增加作物的生产效力，已开发了多种防治害虫的方法，其中包括环肽的应用。Jennings等人研究表明kalata B1(茜草科耳草属Oldenlandia affinis中含量最丰富的环肽之一)除了具有抗微生物活性，也能抑制危害番茄、玉米和烟草的鳞翅目害虫——澳洲棉铃虫(Helicoverpa punctigera)幼虫的生长和发育。他们发现用含有kalata B1人工饲料饲喂的50%幼虫在处理后16 d死亡。此外，50%存活的幼虫在1龄期发育受到抑制，而对照能正常发育到第5龄期。

图3 A)从Oldenlandia affinis分离得到的环肽家族成员kalata B1的三维结构和表面静电势(PDB编码：1nb1)，箭头指示为二硫键；B)从豌豆分离得到的PA1b的三维结构(PDB编码：1p8b)，表面电势计算中标出了参与PA1b疏水补丁形成的残基(Phe10、Arg21、Ile23和Leu27)，用箭头标出了二硫键；C)从绿豆分离得到的防御素家族成员VrD1的三维结构和表面电势

1年后，Jennings等人评估了kalata B1和B2对棉花主要害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera)的生物活性。从O. affinis分离、纯化得到Kalata B1和B2，二者的不同为5个氨基酸取代物不同，但都具有1个保守的折叠。以植物的浓度水平，把kalata B1和B2都加入人工饲料中。试验结果表明二者对棉铃虫幼虫的致死率分别为20%和28%，幼虫的体重分别为对照的1/3和1/4。

最近，Pinto等人从茜草科Palicourea rigida发现了一个新颖的bracelet类成员，即parigidin-br1。评估了parigidin-br1对重要的甘蔗害虫小蔗螟(Diatraea saccharalis)的杀虫特性，结果表明以1 μM处理后15 d初孵幼虫的死亡率为60%，与对照相比幼虫体中减少46%。有趣的是，Pinto等人也发现paridigin-br1以剂量依赖式(1、5、10 μM)抑制常危害玉米和棉花的鳞翅目害虫草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的昆虫细胞系(SF-9)，这表明环肽对昆虫具有离体和活体活性。

2.1.2 豌豆白蛋白1b(PA1b)

除了环肽外，抑制剂半胱氨酸结(inhibitory cysteineknot，ICK)家族的一个成员，豌豆白蛋白1b主要对米象(Sitophilus oryzae)、谷象(Sitophilus granarius)和玉米象(Sitophylus zeamays)具有杀虫活性，也引起人们的关注。PA1b从豆科植物(例如豌豆)种子中提取，为1个含有37个氨基酸残基的富含半胱氨酸的肽，由PA1基因编码，翻译后修饰产生2个成熟的肽PA1a(6 kDa)和PA1b(3.8 kDa)。有趣的是，对豌豆中编码PA1b同源物的数个核苷酸序列研究表明此类杀虫肽具有多基因特性。从结构上看，PA1b为与弹性loops相连，3个二硫键稳定的三链反向平行β-折叠(图3B)。和环肽一样，在不考虑其环骨架的情况下，此结构排列也赋予PA1b耐酶降解性和热稳定性，此特性支持PA1b是目前所知的很少的经口活性肽之一。除了knottin折叠，PA1b表面具有静电性和两亲性(图3B)，与来自漏斗网蜘蛛(Hadronyche infensa)的蜘蛛毒素ACTX-Hi:OB4219的相似，表明此物质具有阻碍通道活性，分别来自中华鲎(Tachypleus tridentatus)和垂序商陆(Phytolacca americana)的抗微生物和抗真菌的蛋白tachystatin A和PAFP-S也具有此情况。

一些研究已评估了PA1b的杀虫潜力，表明其具有杀灭米象、谷象和玉米象等谷物象甲和尖音库蚊(Clulex pipiens)和埃及伊蚊(Aedes aegyptii)等人类疾病传播媒介的作用。另一方面，好像PA1b对棉夜蛾(Spodotera littoralis)和欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)等其他农艺重要毛虫没有活性，表明PA1b的毒性活性和昆虫科没有相关性。为了弄清PA1b的作用机制，da Silva等人评估了取代单个残基的影响和PA1b对敏感和抗性米象品系以及SF9昆虫细胞的活性。在此研究中，得到13个PA1b突变体，其中与PA1b的两亲性/静电性(Phe10、Arg21、Ile23和Leu27)有关的残基被丙氨酸取代。结果，发现受体结合和杀虫活性与PA1b一面的理化特性的保持有本质的相关性，对PA1b表面暴露的疏水补丁(hydrophobic patch)修饰导致离体和活体杀虫活性的显著下降或丧失。也好像即使生物活性减少或没有，缺少Phe10、Arg21、Ile2和Leu27的突变体能保持野生型PA1b折叠和对降解有耐受性，再一次说明疏水补丁对PA1b杀虫活性的重要性。主要通过化学分析和对这些肽的离体折叠研究了PA1b突变体和异构体。然而，最近的研究表明通过农杆菌渗入法(Agroinfiltration)PA1b和其类似物能够在本氏烟中异源表达，且能以最大量产生8 d。此策略已能使生物活性PA1b异构体成功大量表达，表明PA1b在农用工业可有多种用途。

2.1.3 防御素

除了上面提到的CCK和ICK杀虫肽外，已知的γ-硫堇蛋白防御素为富半胱氨酸家族，由45～54个氨基酸组成的碱性肽。已确定豌豆、萝卜和大麦等一些植物组织中的此家族的成员。已有文献详尽地介绍了防御素的三维结构，除了PhD1外，其他防御素的CSαβ模体中含有1个α-螺旋和被4个二硫键稳定的三链反平行β-折叠，一共有5个二硫键。除了二硫键中的8个高度保守的半胱氨酸残基外，防御素家族成员也共有其他重要残基，包括Gly13、Gly34和Glu29，以及11位的1个芳香族残基。此外，这些保守残基侧面区域可能变化大，这可能是防御素呈现多种生物活性的原因。如已发现的抗细菌、抗真菌、杀虫，抑制α-淀粉酶和蛋白酶的活性。

Chen等人报道了对绿豆象(Callosobruchus chinensis)有杀虫活性的植物防御素。在此研究中他从抗豆象的绿豆中分离和过度表达(不同体系)了编码新颖防御素的cDNA，命名为VrCRP。评估了含有不同量VrCRP的人工种子抑制绿豆象成虫出现的活性，结果，含有0.2% VrCRP的种子彻底阻碍了豆象的发育。数年后，此研究团队也报道了此肽的溶液结构，除了含有半胱氨酸稳定的αβ模体，也具有1个不寻常的310螺旋，此结构可能是由于位置23的精氨酸被保守的谷氨酸取代导致的Thr10位移诱导产生。此外，Chen等人也提出来自绿豆的VrD1通过抑制昆虫中肠的多糖水解酶而有杀虫活性，而β2和β3间的loop可能是其结合位点(图4)。最近，在转基因作物领域，Choi等人提议在水稻体内表达来自芜菁(Brassica rapa)的植物防御素BrD1以赋予水稻抗褐飞虱(Nilaparvata lugens)的能力。在生测中发现，表达BrD1的转基因水稻品系在接种褐飞虱后5 d内能成功地降低若虫的成活率，与野生敏感对照相比致死率为约78.6%～95.7%。这些数据清晰地表明植物防御素在抗虫作物的开发中会有很好的前景。

2.1.4 Jaburetox-2Ec：来源于刀豆(CanavaIia ensiformis)的不寻常的杀虫肽

除了以上提及的肽类，在此部分介绍从刀豆中的脲酶同工酶——刀豆毒素衍生而来的不寻常的肽jaburetox-2Ec的杀虫活性。研究表明在将刀豆毒素饲喂于产生组织蛋白酶的害虫秘鲁皮蠹(Dysdercus peruvianus)和四纹豆象(Callosobruchus maculatus)试验中，此物质是有效的杀虫毒性蛋白。然而，此杀虫活性是刀豆毒素被昆虫组织蛋白酶水解产生10 kDa杀虫肽pepcanatox所致。Mulinari等人介绍了在异源体系(大肠杆菌)产生相当于pepcanatoxde的重组肽jaburetox-2Ec的方法。他们研究表明用含有0.01%(w/w)纯jaburetox-2Ec的棉花种子饲喂秘鲁皮蠹3龄幼虫11 d，幼虫全部死亡。也报道用含有16.3 μM jaburetox-2Ec的饲料饲喂草地贪夜蛾3龄幼虫2 d，虫体比对照小20%。此外，草地贪夜蛾幼虫摄取47 μM jaburetox-2Ec后全部死亡。从结构看，用从头建模预测jaburetox-2Ec具有1个β-发夹的三维理论模型，成孔肽以及神经毒素也好像具有此结构。

图4 昆虫中肠中主要作为拒食剂干扰营养吸收的蛋白质化合物的作用机制

2.2 杀虫肽酶抑制剂

在蛋白质化合物中，植物肽酶抑制剂(PIs)是在新栽培品种中异源表达的一类有发展前景的物质，是应对昆虫和植物病原体对当前农药抗性不断增加的可靠的替代方法。它们的结构特性决定其主要被1个基因激活，因此进行了PI在转基因植物中表达的多个研究，以增加作物的抗性。

PIs普遍存在于植物的块茎和豆科植物的种子中，但也在数种植物的不同组织中发现。虽然还没有完全弄明白其生理作用，但有证据表明植物以贮存蛋白(一般在贮存组织中达10%)积累PI，PI也被用于应对机械性受伤和机会性侵染。另一方面，PI通过抑制昆虫中肠中的蛋白酶活性，减少昆虫生长和发育必须的氨基酸的量，使植物防御植食性害虫的危害。分子量为3～25 kDa的PI能够与靶标蛋白酶形成稳定的复合体，阻碍酶到达活性位点。文献介绍PI能够作用于4类蛋白酶：丝氨酸、半胱氨酸、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶，因此，在发现有的抑制剂同属于多个类别之前，一直根据酶抑制剂的催化位点的化学性质对其分类。根据Rawling等人的提议和更新到2007年的植物PI数据库，至少有16个植物蛋白酶抑制剂类别。其中，Kunitz和Bowman-Birk类别被研究最多，用于防治农业昆虫和病原菌。表2列出了重要作物中发现的类别。

表2 根据重要作物中序列的相似性对蛋白酶抑制剂家族进行分类

续表

在暴露较多的围绕P1残基的loop中的每一抑制域有一反应位点肽键，根据位点的数量，可分为简单抑制剂或复杂抑制剂，也即相应地为同型或异型的；包括修饰的抑制剂，大部分抑制剂含有二硫键。除了半胱氨酸-PI和金属蛋白酶抑制剂外，其他家族可能都含有丝氨酸蛋白酶和另一机械类(methanistic class)蛋白酶，即主要对丝氨酸蛋白酶有活性但也抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的Kunitz类。

Kunitz类蛋白酶抑制剂是广泛存在于不同植物家族的最大的蛋白酶抑制剂类别，但主要存在于豆科种子中。被纯化和表征的第一个植物Kunitz类抑制剂为1945年从大豆获得的胰蛋白酶抑制剂(大豆胰蛋白酶抑制剂-STI Kunitz)。此家族的成员具有1个典型的构型，能够与靶标酶形成非常牢固的复合体。丝氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶主要被Kunitz类抑制。植物kunitz类抑制剂含有约180个氨基酸残基，分子量为18～22 kDa，结构为1个多肽链，也称为“单头”(single headed)；半胱氨酸残基含量低(一般4个，Cys39-Cys86和Cys136-Cys145)，参与了1个或2个二硫键的形成。一般，Kunitz类抑制剂只有一个反应位点，通常为赖氨酸或精氨酸，但有些抑制剂可能含有另一独立反应位点。Kunitz类对不同蛋白水解酶有活性，但通常为胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等丝氨酸蛋白酶，因此被认为对未来植物防御昆虫方面具有很重要的作用。简而言之，昆虫摄入此类蛋白酶抑制剂后，中肠中的蛋白酶被完全抑制，使昆虫对基本氨基酸的吸收下降，直到饥饿而死。最近，许多研究认为表达Kunitz抑制剂的基因的转基因植物对害虫和病原菌有防御性。

1946年D.E. Bowman从大豆种子中分离纯化得到第一个Bowman-Birk抑制剂(BBI)，1963年Y. Birk对其进行了表征。在数种单子叶和双子叶植物中可发现此类物质，它们主要贮存在种子中，但也会因伤诱导在叶片中产生。BBI类是富含半胱氨酸的蛋白质，为含有2个反应位点(双头抑制剂)的小分子多肽(8～9 kDa)，2个反应位点独立但同时与同源蛋白酶反应。通常，这2个同源域由1个具有胰蛋白酶反应点的N-末端和与胰凝乳蛋白酶反应的C-末端组成，由7个保守的二硫键稳定。核磁共振(NMR)和x射线晶体的研究表明双头BBI的2个反应点位于分子的两端(图5B)。与胰蛋白的S1点相应的P1残基为精氨酸或赖氨酸，负责识别活性位点，并与其结合。疏水亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和络氨酸是与胰凝乳蛋白酶位点结合的临近残基，而丙氨酸仅对弹性蛋白酶位点有选择性。此外，BBI家族含有一个独特的与二硫键连接的含有9个残基的loop，以类底物方式与蛋白酶结合。

图5 (A)来源于大豆的Kunitz型抑制剂(PDB编码：lavw)，(B)来自于豇豆的Bowman-Birk抑制剂(3ru4)，(C)来自于茄子的防御素(5cad)，(D)来自于雪花莲的甘露糖凝集素(PDB编码：lniv)

对于其他类PPI，用于转基因作物提高作物抗植食性害物要更好于直接用于田间。一些研究已表征了编码Bowman-Birk类蛋白酶抑制剂的基因，目前正在进行一些大田试验来评估过表达此PI增强作物抗昆虫的价值。

2.3 杀虫剂——和几丁质结合的豌豆球蛋白(7S贮存蛋白)

在20世纪70年代热带农业国际研究所确定了对四纹豆象具有高度抗性的第一个基因型豇豆(栽培品种TVu 2027)，并以此栽培品种培育了数个其他的抗性品系。起初，对四纹豆象的抗性被认为与豇豆中表达的高水平胰蛋白酶抑制剂有关。然而，随后Macedo等人研究表明不同豌豆球蛋白的存在是抗性产生的最可能原因。自此，发现豌豆球蛋白具有多种生物特性，如抗微生物活性、结合蔗糖活性和杀虫活性。

一般，豌豆球蛋白被描述为不同的7S贮存球蛋白(约20.1～94 kDa，多亚基物)，被不同程度糖基化的多基因家族编码，通常在豆科植物种子和非豆科植物中发现。已获得一些豌豆球蛋白的晶体结构，报道主要为被非共价键相互作用稳定的三聚体构象。最近，也报道茄子(Solanum melongena)中三聚体豌豆球蛋白的每个单体由疏水和阴离子配体结合口袋2个区域组成(图5C)。此外，研究已表明这些糖蛋白对水解具有耐受性，说明对几丁质有很强的亲合力，已知几丁质在数种昆虫的围食膜形成中具有重要作用(图4)(PM)。在此种情形下，已报道豌豆球蛋白与几丁质结合特性影响了昆虫围食膜的渗透性和结构，而可能导致围食膜的生理机能的改变，因此直接影响幼虫的发育和存活。此外，由于豌豆球蛋白与含几丁质的表面的特异性结合，也抑制具有几丁质细胞壁的酵母细胞。然而，有趣的是，豆象甲虫(例如四纹豆象)不具有真正意义上的PM，但以围食膜凝胶代之。在此种情况下，研究已表明7S贮存豌豆球蛋白可能被中肠上皮细胞吸收，近而在血淋巴中以三聚体形式流动，也达到内脏器官，包括脂肪体和马氏管，导致豆象甲虫幼虫生理不稳定。说来奇怪，最近，Alexandre等人发现四纹豆象雄雌虫脂肪体中的豌豆球蛋白能够部分地水解为数个片段，最后沉积在这些昆虫的卵中，成为防御性武器，因此提高四纹豆象幼虫后代的存活率。

评估了7S贮存豌豆球蛋白对墨西哥豆象(Zabrotes subfasciatus)、小蔗螟、四纹豆象、地中海实蝇(Ceratitis capitata)和印度谷螟(Plodia interpunctella)等许多昆虫的幼虫和成虫的活性。Moura等人研究表明从青皮象耳豆(Enterolobium contortisiliquum)种子(EcV)中分离得到的豌豆球蛋白混入饲料中饲喂四纹豆象和墨西哥豆象幼虫，LD50分别为1.1和0.43%(w:w)；而使四纹豆象和墨西哥豆象幼虫体重减少50%的有效剂量(ED50)分别为1.03和0.65%(w:w)。此外，1年后他们报道从Erythrina velutina种子分离的豌豆球蛋白，称为EvV，对四纹豆象和墨西哥豆象的LD50分别为0.26和0.10%(%，w:w)，以及ED50分别为0.19和0.14%(w:w)。此外，发现处理12 h后，EvV不仅耐四纹豆象和墨西哥豆象幼虫酶的水解，而且在施用24 h后，耐墨西哥豆象幼虫酶的水解。在2个研究中EcV和EvV都为耐蛋白水解，能结合几丁质的蛋白质，表明这些物质可作为新颖的天然杀虫剂，经胃毒作用防治害虫。

豌豆球蛋白除具有杀豆象活性，研究也表明来自豇豆的豌豆球蛋白能够与小蔗螟幼虫的围食膜结合，用含有2%(w:w)豌豆球蛋白的人工饲料饲喂，与对照相比成虫的出现量减少40%。相似地，Macedo等人报道用含有EvV的人工饲料饲喂地中海实蝇，LD50和ED50分别为0.14和0.12%(w:w)，这可能与幼虫围食膜中的EvV与几丁质结合特性和EvV在地中海实蝇消化道中对蛋白酶水解敏感性低有关。同时，他们研究发现把EvV加入人工饲料中饲喂对印度谷螟幼虫的LD50(致死)和ED50(体重减少)分别为0.23和0.27%(w:w)。然而，在此种情况下，EvV对酶解敏感，能够产生具有免疫活性和能够结合到围食膜基质的数个片段，这表明EvV在鳞翅目昆虫中肠中被分解后具有不同的作用。

2.4 杀虫剂——与碳水化合物结合的植物凝集素

植物凝集素，最初被称为凝集素，由具有至少1个可逆性结合甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖(几丁质-多聚物)等特异性单-和/或寡糖的非催化区域的各种各样结合碳水化合物的蛋白质组成。根据整体区域排列，植物凝集素被分为4个主要类别，部分凝集素(merolectins)：只有1个结合碳水化合物的区域；全凝集素(hololectins)：2个或多个具有相同的或高度同源的结构的结合碳水化合物的区域；超凝集素(superlectin)：具有能够识别结构无关碳水化合物的2个或多个结合碳水化合物区域；嵌合凝集素(chimerolectins)：具有1个或多个结合碳水化合物区域，这些区域与具有额外生物活性的另一区域有关。此外，随着分子生物学和生物化学的发展，在区域排列知识中增加了序列相似性和进化关系，由此目前把植物凝集素分为12个类别。从结构上看，这些蛋白主要由与loops相连的反平行的β-折叠组成，含有一定的螺旋结构(图5D)。此外，可能发现被氢键、盐和疏水相互作用稳定的二聚和/或四聚体构型。对于其生物学特性，研究表明植物凝集素对鞘翅目、双翅目、鳞翅目和同翅目等害虫具有很好的杀虫活性。对于其作用机制，已有人提出植物凝集素可能与昆虫中肠围食膜相互作用，抑制营养的吸收；结合到中肠上皮细胞上的糖蛋白上，破坏组织(图4)；干扰昆虫基因的表达；与靶标昆虫刷状缘膜囊(brush border membrane vesicles, BBMV)受体蛋白相互作用；与昆虫口器区域的感觉感受器上的碳水化合物结合，破坏膜的完整性，影响昆虫检测食物的能力。此外，植物凝集素对蛋白酶的降解有高抗作用。

Macedo等人已从不同植物品种开发了具有杀虫活性的凝集素，能够防治经济重要性害虫。在其研究中，源于栾树(Koelreuteria paniculata，KpLec)种子和羊蹄甲(Bauhinia monandra，BmoLL)叶的凝集素加入人工饲料饲喂，对四纹豆象的LD50分别为0.7和0.3%(w:w)。然而，只有KpLec对鳞翅目地中海粉螟有活性，LD50为0.65%(w:w)。相似地，Coelho等人报道来自Annona coriacea (ACLEC)的凝集素混入人工饲料饲喂对地中海粉螟幼虫的LD50为1.5%(w:w)。除了能降低昆虫幼虫的存活率，Macedo等人也研究表明Talisi esculenta凝集素(TEL)的杀虫活性受不同碳水化合物的调节，加入甘露糖后其对四纹豆象的活性完全消失，表明碳水化合物-凝集素与昆虫消化道中的复合糖相互作用。雪花莲凝集素(Galanthus nivalis: agglutinin GNA)等其他植物凝集素被昆虫摄入后能够与中肠上皮细胞相互作用，随后进入血淋巴，由此可对这些分子进行新的生化技术应用。

有趣的是，为了把这些蛋白质用作其他杀虫分子的载体，已开发了凝集素与简单和/或复杂碳水化合物反向结合的能力。Fitches等人研究了GNA携带和传递杀虫螨毒液神经毒素1(SFI1)到番茄蛾(Lacanobia oleracea)幼虫的血淋巴中的潜力。结果，他们发现虽然GNA和SFI1单独对番茄蛾幼虫没有急性毒性，但饲喂含有2.5%(w:w)SFI1/GNA结合体的人工饲料6 d后，番茄蛾1龄幼虫的死亡率为100%。此外，此结合体也引起约90%的第4和5龄幼虫死亡，且随着剂量增加，死亡率增加。数年后，他们报道SFI1/GNA结合体对烟蚜(Myzus persicae)和褐飞虱(Nilaparvata lugens)有毒。此发现清楚地表明蛋白质结合体策略可作为替代性方法用于作物保护，用植物凝集素作为载体把毒素传递到昆虫体内的靶标点。

随着当前基因工程的发展，为提高作物的产量在作物体内表达植物凝集素编码序列已获得关注。Dutta等人利用农杆菌转化法在烟草中首次表达大蒜叶凝集素(ASAL)编码序列。研究发现表达ASAL的转基因烟草田中的烟蚜存活率约16%，而对照的约75%。Dutta等人发现与对照相比，表达ASAL的转基因水稻处理的褐飞虱的存活率和繁殖率分别降为36%、32%，二点黑尾叶蝉(Nephotettix virescens)40.5%、29.5%。有趣的是，Bharathi等人通过稳定表达ASAL和FNA的转基因水稻间的杂交，逐渐增加水稻中2个凝集素基因(ASAL和GNA)，来进一步研究植物转化的概念。在此研究中，他们发现进一步杂交的水稻品系被主要刺吸式害虫危害的程度要轻于其母本转基因作物，因为其能更有效地降低昆虫的存活率、取食能力和繁殖力。总的来说，有关植物凝集素的所有这些发现表明这些分子在防治害虫方面有巨大的发展潜力。

3 新一代植物源杀虫剂的挑战和发展前景

虽然文献对数种植物次生化合物的杀虫活性进行了较广泛的介绍，但其中只有一些物质被批准使用和商业化，且主要用于有机农业。从商业化角度看，此类植物药剂由于缺乏商业化所需的生物活性和防效的标准和技术而受到了限制。植物化学物质的固有特性(作用慢、防效变化大、持效期短)和没有统一标准的技术是其农业市场进入率低的主要原因。而蛋白类化合物比次生代谢物在环境中更稳定和持效期更长，可利用纳米粒子工程化技术优化而更好地被昆虫摄入和接触。然而，依靠种植作物来专门提取杀虫剂的道路还很遥远，因为这需要在土地和技术上进行巨大的投资。如果能以低成本、高效率容易的合成，特别是预测和合理设计蛋白质结构以增加其生物活性，就可获得大量的此类物质。

转基因表达蛋白类化合物可能是增加植物防御能力最可靠的方法。蛋白质化合物由于结构特性，需要把其编码基因(1个基因)转入目标植物，在此植物组成型启动子的作用下表达。此外，植物基因组的转化作为产生异源蛋白、以植物为离体生物工厂、优化化合物的产出和使可能的环境风险最低化的方式具有很大吸引力。基因工程的另一优势就是重组基因，作为防御机制直接在作物体内表达的可能性。在近年科学家在基因编码蛋白化合物，把这些基因转入作物使作物对害物具有防御能力方面进行了许多研究。最近，CRISPR系统的发现和Cas9用作易重组核酸酶，组成了依靠序列特异性双链断裂诱导的基因组工程。自此，研究焦点变为诱导许多植物发生NHEJ-介导的遗传突变，这通过把表达核糖酶的DNA转入植物细胞获得，通过隔离不含有转基因DNA的后代而消除。此新工具已改变分子生物学，开辟了提高植物防御能力的新领域。

从长远来看，昆虫抗性可能降低此技术的效果。且杀虫剂越有效，选择压力越大，常导致抗性的快速进化。这与杀虫剂为化学物还是转基因植物表达的物质(plant-incorporated protectant)无关。生物进化和获得抗性是发生在许多环境中的进化机制，并不总是与转基因生物的出现有关。

大多数的消费者认为植物源产品是用于有机农业，然而，本文认为植物源物主要是植物产生，但可以多种方式开发，能够用于昆虫的防治和大规模农业生产中。