新型杀菌剂Pyraziflumid的合成及生物活性

张宝俊，郭崇友 编译

(南京红太阳股份有限公司，南京 211300)

已获得了与萎锈灵(carboxin)相关的甲酰胺(carboxamide)类化合物，并已证明其可选择性防治由担子菌纲病原菌引起的植物病害。1990年发现的2-氯-N-(1,1,3-三甲基茚满-4-基)吡啶-3-甲酰胺(BC723)能有效防治由子囊菌纲病原菌引起的灰霉病及担子菌纲病原菌引起的小麦叶锈病(Puccinia recondita)和水稻纹枯病(Rhizoctonia solani)。BC723具有抑制灰葡萄孢菌和水稻纹枯病菌等病原菌的线粒体琥珀酸脱氢酶复合物(SDC)的活性。BC723类似物对灰霉菌、水稻纹枯病菌杀菌活性的构效关系在之前已有研究报道。在这之后，以BC723为先导化合物发现了吡噻菌胺{N-[2-(1,3-二甲基丁基)-3-噻吩基]-1-甲基-3-(三氟甲基)吡唑-4-甲酰胺}，一些其他琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHI)类广谱杀菌剂也被发现和推出。几乎所有的这类杀菌剂都具有吡啶或者吡唑基团作为羧酸部分。但前期有关N-(1,1,3-三甲基茚满-4-基)-甲酰胺类的构效关系研究表明，3-取代吡嗪-2-甲酰胺类也可能具有与2-取代吡啶-3-甲酰胺类一样高的活性。据此，为了发现另外一种比BC723更广谱和更有效抑制SDC的新型SDHI杀菌剂，开始重新对羧酸部分进行研究。对吡嗪类化合物验证中，发现3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺类对多种植物病害具有较高的抑制活性。通过对一系列化合物杀菌效果的优化研究，最终发现了pyrazi fl umid[N-(3′,4′-二氟联苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺](图1)。Pyrazi fl umid对蔬菜、果树、草坪、水稻的灰霉病、菌核病、白粉病等多种病害具有极高活性。该产品已经通过了日本植物保护协会的官方评审，代号为NNF-0721，并已在日本获准登记。本文阐述了吡嗪-2-甲酰胺类的发现、化学性质，同时通过对黄瓜灰霉病、小麦叶锈病和大麦白粉病防治效果的评价探讨了构效关系。

图1 Pyrazi fl umid的发现

1 材料和方法

1.1 化合物制备

使用以四甲基硅烷为内标的Bruker ARX-400 NMR谱仪，通过1H-NMR光谱确定化合物的化学结构。以Mettler FP80 熔点测试仪测定熔点，测定结果未校正。

1.1.1 合成

根据图2所示，测试化合物根据2种路线中的任意一条路线来合成的。

图2 3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺的合成路线

第1条路线(路线A)是：甲基3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸盐(2)和相应的联苯胺(4)反应生成N-(取代的联苯-2-基)3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺(5)。第2条路线(B)是：由甲基3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸盐(2)合成3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸(3)后与相应的联苯胺(4)合成而或得。甲基3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸盐(2)由甲基3-氯吡嗪-2-羧酸盐(1)三氟甲基化获得。下文以pyraziflumid和化合物14的合成为例进行介绍。

1.1.2 甲基3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸盐(2)

将32.5 g (188 mmol)甲基3-氯吡嗪-2-羧酸(1)、35.8 g (188 mmol)碘化铜混合物加入到60 mL二甲基甲酰胺(DMF)和60 mL甲苯中，在温度达到100 ℃时加入54.2 g (282 mmol)甲基-2-(氟磺酰)二氟乙酸盐。在氩气中混匀后加热到115 ℃保持2 h。冷却后，反应混合物通过硅藻土过滤，随后用乙酸乙酯稀释滤液。用水和盐水洗涤有机层，加入硫酸钠使其干燥，然后在真空中浓缩。残留物通过色谱柱(SiO2，正己烷∶醋酸盐=4∶1)得到无色油状液体即为甲基3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸盐(2) (24.0 g，收率62%)。1H-NMR (CDCl3) δ ppm: 8.85 (d, 1H), 8.83(d, 1H), 4.05 (s, 3H)。

1.1.3 3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸(3)

将9.8 g (47.5 mmol)的化合物甲基3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸(2)溶于30 mL乙醇中，水冷却后加入KOH水溶液[3.2 g (48.0 mmol) KOH溶于40 mL水]，在室温下搅拌1.5 h。反应混合液在真空下浓缩，残留物用乙醚清洗。水层用c-HCl酸化，随后用乙酸乙酯萃取并用水和盐水洗涤。用无水硫酸镁干燥，真空浓缩得到白色晶体3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸(3)(7.00 g，收率63%)。熔点146.5～147°C.1H-NMR(CDCl3) δ ppm: 8.96 (d, 1H), 8.88 (d, 1H), 3.2-3.9 (br,1H)。

1.1.4 N-(取代的联苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺 (5)

1.1.4.1 通过路线A合成N-(3′,4′-二氟联苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺 (pyrazi fl umid)

将40.0 g (195 mmol) 3′,4′-二氟联苯-2-胺(4)、40 mL N,N-二甲基乙酰胺和28%甲醇钠混合物加入118 mL(580 mmol)甲醇溶液中，再加入50.1 g (243 mmol)甲基3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸盐(2)，于室温下搅拌9 h。将反应混合液倒入含有250 g冰水和50 mL的c-HCl混合液中，随后用乙酸乙酯进行萃取。萃取液用水和盐水洗过之后在真空条件下浓缩，残留物在庚烷和乙酸乙酯中重结晶后得到淡黄色晶体(pyrazi fl umid)(60.4 g，收率86%)。熔点119～120 ℃。1H-NMR(CDCl3) δ ppm: 9.56 (s, 1H), 8.83 (d,1H), 8.64 (s, 1H),8.54 (d, 1H), 7.47 (dt, 1H), 7.3 (m, 4H), 7.19 (m,1H)。水中溶解度：2.32×10-3g/L(20 ℃)，分配系数为log Po/w：3.51 (25 ℃)。

1.1.4.2 通过路线B合成3-(三氟甲基)-N-[4'-(三氟甲基)联苯-2-基]吡嗪-2-甲酰胺(14)

将192 mg (1.00 mmol)3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸(3)，238 mg (1.00 mmol) 4'-(三氟甲基)联苯-2-胺(4)和255 mg (1.00 mmol)2-氯-1-甲基吡啶盐碘化物加入到10 mL的四氢呋喃溶液里，混合均匀后再加入303 mg(3.00 mmol)三乙胺，于室温下搅拌9 h。用乙酸乙酯稀释反应混合液，随后用水和盐水洗涤。有机层用硫酸镁酸酐干燥，然后在真空中浓缩。将残留物用硅胶柱层析柱(洗脱液：己烷∶乙酸乙酯=2∶1)纯化，得到的白色固体即为3-(三氟甲基)-N-[4'-(三氟甲基)联苯-2-基]吡嗪-2-甲酰胺(化合物14)(293 mg，收率62%)。熔点147～148 ℃。1H-NMR (CDCl3) δ ppm:9.5 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.58 (d, 1H), 8.54 (d, 1H), 7.76(d, 2H), 7.59 (d, 2H), 7.48 (t, 1H), 7.3 (m, 2H)。

1.4.3 其他衍生物

其他的衍生物也用相似的方法合成(利用吡嗪羧酸/脂和相应的联苯-2-胺以及市售试剂和溶剂)。

2 生物测定

2.1 施用方法

将每个化合物制备成有效成分100 g/L的乳油制剂，以含湿润剂(Mai-Rinoh®, 0.1 mL/L)的水稀释成一定浓度(有效成分0.5～200 mg/L)。于黄瓜1.5叶期、小麦幼苗2叶期、大麦苗2叶期时喷施相当于每公顷2 000 L的测试溶液。风干后，接种靶标真菌，每个处理2个重复。

2.2 接种方法

2.2.1 黄瓜灰霉病

将处理组的黄瓜子叶切除，置于塑料盒中。将一定孢子浓度(1×106孢子/L)灰葡萄孢菌悬液接种至具马铃薯蔗糖培养基的滤纸片(直径6 mm)上，将滤纸片置于子叶中心，于15 ℃湿润环境下保持5 d。

2.2.2 小麦叶锈病

将叶锈菌(1×106孢子/mL)接种到被处理过的小麦上，置入20 ℃、相对湿度100%的培养室，于黑暗条件保持24 h。随后将接种的植物置于温室培养7 d。

2.2.3 大麦白粉病

将从感病植物直接采集的大麦白粉病病原菌(Blumeria graminis f. sp. Hordei)孢子涂布于处理大麦植株上，接种后温室中放置7 d。

2.3 评价方法

以植物叶片侵染面积来评价防治活性。目测法估量侵染面积，根据下式计算防治率(%)：防治率=(未经处理叶片被侵染面积－经处理叶片被

侵染面积)/未经处理叶片被侵染面积×100通过防治率计算EC80，评价测试化合物的抗真菌活性。EC80为防治效果达到80%时测试化合物的浓度。

3 结果与讨论

3.1 吡啶-3-和吡嗪-2-甲酰胺类的生物活性

根据之前发表的关于N-(1,1,3-三甲基茚满-4-基)甲酰胺类的构效关系的文章，3-取代吡嗪-2-甲酰胺类对由担子菌纲和子囊菌纲病原菌引起的病害的防治活性和2-取代吡啶-3-甲酰胺类一样高。图3总结了N-(1,1,3-甲基茚满-4-基)吡啶-3-和吡嗪-2-甲酰胺类化合物的关系及其对灰霉病和小麦叶锈病的杀菌活性。就吡啶-3-甲酰胺类来说，2-甲基吡啶-3-甲酰胺衍生物(1)对这2种病害具有中等活性。2-位取代基由甲基变为氯原子的BC723，对叶锈病的防治活性不变，但对灰霉病的防治活性提高了。此外，2-三氟甲基-吡啶-3-甲酰胺衍生物(3)对叶锈病的活性高于2-氯-取代衍生物(BC723)，而对灰霉病的防治活性相当。对吡嗪-2-甲酰胺类而言，3-甲基吡嗪-2-甲酰胺衍生物(4)对这2种病害具有中等活性。3-位取代基由甲基变为氯原子的化合物5，同样对叶锈病的防治活性不变，但对灰霉病的防治活性显著提高了。如果吡嗪-2-甲酰胺类的取代基效应与吡啶衍生物有相似的趋势，那么就可以预测3-(三氟甲基)吡嗪衍生物对这2种病害的防效优于BC723。但此前对3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸一无所知，被当作一种新化合物来合成。利用其合成了3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺类，并测试了它们的各种杀菌活性。

图3 N-(1,1,3-三甲基茚满-4-基)吡啶和吡嗪酰胺类的杀菌活性

表1总结了N-(1,1,3-三甲基茚满-4-基)吡啶-3或吡嗪-2-甲酰胺类化合物及其对大麦白粉病、黄瓜灰霉病和小麦叶锈病的杀菌活性。在吡啶类衍生物中，2-(三氟甲基)吡啶-3-甲酰胺(3)对灰霉病的防治活性与氯取代衍生物(2, BC723)相当，而对小麦叶锈病的防治活性仅比后者略高一点。三氟甲基取代衍生物(3)对大麦白粉病的防治活性低于氯取代衍生物(2)。在吡嗪类衍生物中，3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺(6)对灰霉病的防治活性与氯取代衍生物(5)相当，这与吡啶类衍生物的情况一致。但(三氟甲基)吡嗪衍生物(6)对小麦叶锈病和大麦白粉病的防治活性比氯取代衍生物(5)分别高10倍和20～200倍。因此，3-(三氟甲基)-吡嗪-2-甲酰胺对多种植物病害的防治活性比其他甲酰胺更高。这种活性的大幅度增强似乎与3-取代吡嗪-2-甲酰胺类特有的三氟甲基的取代基效应有关，因为2-取代吡啶-3-甲酰胺类并没有出现这种情况。

表1 N-(1,2,3-三甲基茚满-4-基)吡啶-3-或吡嗪-2-甲酰胺类及其生物活性

据报道，一些N-(联苯-2-基)甲酰胺类具有与N-(1,1,3-三甲基茚满-4-基)甲酰胺类化合物类似的生物活性。研究了(三氟甲基)吡嗪基团对N-(联苯-2-基)甲酰胺的这一特殊取代基效应的普遍性，结果见表2。3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺(8)对灰霉病的防治活性略高于氯取代衍生物(7)，但其对大麦白粉病和小麦叶锈病的防治活性均比氯取代衍生物(7)高10～100倍。因此，同样在N-(联苯-2-基)甲酰胺类化合物中观察到(三氟甲基)吡嗪基团的特定取代基效应。由于N-(联苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺对所有这3种病害均具有均等的较高防治活性，因此后续研究将对联苯基部分的取代基进行优化。

3.2 构效关系

3.2.1 N-(4'-取代联苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺类

联苯基部分4'-位被烷基基团、三氟甲基或者卤原子取代的N-(联苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺类的杀菌活性见表3。甲基或者叔丁基衍生物(9、10)对灰霉病的防治活性与未取代的化合物(8)相当，但对叶锈病和白粉病的防治活性低于后者。卤原子或三氟甲基衍生物(11－14)对叶锈病防治活性与未取代的化合物(8)相当，但对灰霉病和白粉病防治活性高于后者。这表明联苯基4'-位的吸电子基团可能有助于提高化合物的杀菌活性。因此，在后续研究中考察了各个位置的取代基效应。

表2 N-(联苯-2-基)-3-取代吡嗪-2-甲酰胺类及其生物活性

表3 N-(4'-取代联苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺类及其生物活性

3.2.2 N-(取代联苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺类

表4为2′-、3′-或4′-位被氟原子、氯原子或三氟甲基取代的N-(联苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺类化合物及其杀菌活性。4′-位被氟原子取代的衍生物(11)对灰霉病的防治活性最强， 3′-位取代的衍生物(15)次之，2′-位取代的衍生物(16)的活性最低。类似地，4′-位被氯原子和三氟甲基取代的衍生物(12、14)对灰霉病的活性是各自位置异构体中最高的。3′-位被氟原子取代的衍生物(15)对叶锈病的活性最高，其次为4′-和2′-位取代的衍生物(11、16)。类似地，3′-位被氯原子和三氟甲基取代的衍生物(17、19)对叶锈病的活性是各自位置异构体中最高的。以上结果表明，测试化合物对灰霉病的防治活性可能主要取决于4′-位的吸电子基团的特异效应，而对叶锈病的防治活性受3′-位取代基的影响。2′-位被氯原子或三氟甲基取代的化合物16和18对灰霉病和叶锈病的活性是各自位置异构体中最低的，这可能是由于2′-位取代不利于对灰霉病和叶锈病的防治活性。

表4 N-(单取代联苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺类及其生物活性

氟原子取代的衍生物(11、15、16)对白粉病的防治活性相当。4′-位被氯原子取代的衍生物(12)对白粉病的防治活性比它的位置异构体(17、18)低，而4′-位被三氟甲基取代的衍生物(14)的活性则比它的位置异构体(19)高。因此，测试化合物对白粉病的防治活性没有观察到上文中提到的取代基的位置特异性效应。

3.2.3 N-(二取代联苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺类

由于已经阐明了在联苯基上具有单个取代基的衍生物的构效关系，接下来测定了具2个取代基的衍生物的杀菌活性。联苯基的2个位置被氟原子、氯原子或三氟甲基取代的N-(联苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺类及其杀菌活性见表5。在3'-和4'-位为氟原子、氯原子或三氟甲基的化合物20－23对灰霉病的防治活性与4'-位为氟原子、氯原子或三氟甲基的对应单取代化合物11、12和14一样高。化合物20－23对叶锈病的防治活性也与3'-位为氟原子或氯原子的对应单取代化合物15和17相当。对在3'和4'-位取代的衍生物评价结果表明，4'-位和3'-位的取代基的位置特异性可独立地起作用，提高对灰霉病和叶锈病的防治活性。但化合物20和23对叶锈病的防治活性比3'-位氟原子衍生物(15)略高。那么，除了3'-位的位置特异性效应外，3'-位的氟原子和4-位的三氟甲基或氟原子对防治叶锈病可能产生协同效应。

表5 N-(二取代联苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺类及其生物活性

3'-和5'-位被氟原子取代的化合物24对灰霉病和叶锈病的活性与3'-位单氟取代衍生物(15)相当。3'-和5'-位被2个氯原子或三氟甲基取代的化合物25和26对灰霉病和叶锈病的活性比3'-位单氯或单三氟甲基取代衍生物(17、19)略低。这些数据表明，对防治叶锈病来说，3'-、5'-双取代的衍生物对3'-和5'-位的位置特异性取代基效应没有产生额外贡献。

2'-和4'-位被氟或氯原子取代的化合物27－29比各自2'-位取代衍生物(16、18)对灰霉病的防治活性高10倍，对叶锈病的防治活性仅略高一点。对灰霉病防治活性的大幅度提高可能是由4'-位的特定取代基效应引起的。2'-和5'-位被氟原子取代的化合物30比2'-位取代衍生物(16)对叶锈病的活性低10倍，对灰霉病的活性相当。这些评价结果也证明了4'-或3'-位的位置特异性取代基效应可能是独立的，还提高了对灰霉病和叶锈病的防治活性。

3'-或4'-位氟取代化合物20、22和23对白粉病的防治活性比其他3'-和4'-双取代的衍生物高。3'-和5'-被氟原子取代的化合物24是3',5'-二取代化合物中对白粉病防治活性最高的。2'-或4'-位被氟原子取代的化合物27和29对白粉病的活性也比2',4'-二氯衍生物(28)高。这些结果表明，在任一位置含有氟原子的二取代的衍生物可能都对白粉病具有较高防治活性。

在所测试化合物中，3'-和4'-位被氟原子取代的化合物20对3种病害均具有最高的活性。通过进一步的检测和田间试验，最终选择了化合物20为开发化合物(pyrazi fl umid)，其凭借优异的性能成为新型杀菌剂候选。

4 结 论

Pyraziflumid是一种新颖SDHI杀菌剂，属3-(三氟甲基)吡唑-2-甲酰胺类，该类化合物与N-(联苯-2-基)以及N-(1,1,3-三甲基茚满-4-基)甲酰胺类类似，对多种植物病害具有极高防治活性。N-(联苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺类的构效关系表明，对灰霉病的防治活性可能取决于4'-位的取代基效应，而对叶锈病的防治活性可能受3'-位取代基的影响。4'-或3'-位的位置特异性取代基效应似乎是独立的，对灰霉病和叶锈病的防治活性起着积极作用。对白粉病的防治活性没有观察到取代基的位置特异性，但在任何位置含有氟原子的双取代衍生物均表现出较高活性。通过评价对3种病害的防治活性探讨构效关系的结果表明，从独特的位置特异性取代基效应的角度来看，作为杀菌剂pyrazi fl umid [N-(3′,4′-二氟联苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺]是最适宜的化合物。