运用OD值对常见畜禽腹泻病原菌计数的研究

时间：2024-05-28

王佳张莉豆思远高军军李勇生

摘要：本研究就畜禽常见腹泻病原菌的生长特性、细菌悬液浊度和细菌计数之间的关系进行探讨，通过对常见畜禽腹泻病原菌大肠杆菌（O8型和O139型）、鸡白痢沙门菌、鼠伤寒沙门菌和鸡伤寒沙门菌不同培养时间段吸光度（optical density，OD）值的测定，结合平板活菌计数法来确定这5种细菌的生长曲线，并对细菌浊度和细菌计数相关性进行统计分析，发现极显著相关（P＜0.01），建立了5种细菌在生长期和稳定期的OD值-细菌数对数的曲线回归方程，O8型大肠杆菌：y=2.55x+6.72（r2=0.96）；O139型大肠杆菌：y=1.45x+8.77（r2=0.95）；鸡伤寒沙门菌：y=4.50x+7.02（r2=0.95）；鼠伤寒沙门菌：y=5.59x+7.67（r2=0.97）；鸡白痢沙门菌：y=9.72x+6.60（r2=0.98）。利用该回归方程可快速准确地确定菌液浓度，为探讨细菌的培养特性、致病机制及动物实验中攻毒剂量的确定等相关实验提供参考依据。

关键词：生长曲线；紫外分光光度法；活菌计数

中图分类号：S852.6 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2023）04-00101-06

在微生物实验中，在细菌毒力的测定和动物攻毒实验时，菌液浓度是重要指标之一，常需要进行准确的细菌计数。细菌生长的测定方法分为直接法和间接法[1-2]，比较常见的是平板计数法和比浊法。平板计数法结果相对准确，但操作复杂且时间较长；比浊法相对简单，但结果易受环境温度、培养基色泽等因素的影响，易发生偶然误差。研究表明，细菌悬液的吸光度与其浓度呈正相关性[3-5]。本研究采用分光光度计，对大肠杆菌（O8型和O139型）、鸡白痢沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡伤寒沙门菌等细菌悬液进行吸光度（optical density，OD）值的测定，结合平板活菌計数的结果，拟建立一种快速准确的方法，为动物实验中攻毒剂量的浓度确定提供科学参数。

1 材料与方法

1.1 菌种

大肠杆菌（Escherichia coli：O8型和O139型）、鸡伤寒沙门菌（Salmonella gallinarum）、鸡白痢沙门菌（Salmonella pullorum）、鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）由甘肃农业大学动物医学院微生物实验室提供。

1.2 仪器与试剂

722s可见分光光度计购自上海精密科学仪器有限公司，TD25-WS低速多管架自动平衡离心机购自长沙湘仪离心机仪器有限公司，麦氏比浊管（0.5-5 McFarland）购自北京中西远大科技有限公司，L棒、蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉等购于北京奥博星生物技术有限责任公司，NaOH购于西安化学试剂厂，K2HPO4购于成都化学试剂厂，NaCL购于天津市标准科技有限公司。

1.3 菌种活化及种子液的培养

试验前将保存的5种菌种接种于普通琼脂斜面培养基上活化，然后接种于无菌新鲜肉汤10 mL中，37 ℃培养18 h后，将培养物倒入无菌离心管内离心10 min（3 000 r/min），用无菌生理盐水洗涤三次后，将菌种配制成1.8×109 CFU/mL的菌悬液，一般情况下每100 mL培养18 h的大肠杆菌或沙门菌培养液，离心10 min（3 000 r/min）后制成20 mL细菌悬液，作为种子液，以备扩大培养用。

1.4 种子液扩大培养

按5％的接种量，将备用种子液接种于200 mL无菌新鲜肉汤中，充分摇匀后置于 37 ℃培养。从培养起每隔1 h/2 h吸取菌液用分光光度计测吸光度值，并结合活菌计数法测细菌浓度，每隔1 h/2 h重复以上步骤（培养10 h及以前的菌液每隔1 h重复以上步骤，培养10 h后的菌液每隔2 h重复以上步骤）。

1.5 吸光度值测定

定时取样，用分光光度计于460 nm/600 nm波长（O8型大肠杆菌和O139型选用460 nm，鸡白痢沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡伤寒沙门菌选用600 nm）测OD值，以无菌肉汤作为对照[6-8]。以时间为横坐标，不同时间段OD值为纵坐标，作图，绘制生长曲线。

1.6 活菌计数

菌液取样后，进行活菌计数。对培养的各菌液进行倍比稀释（培养0～10 h的菌液取10-2～10-9稀释度，培养超过10 h的菌液取10-4～10-10稀释度），分别取100 μL细菌悬液均匀涂布于直径90 mm的平板上，每个稀释度涂3块平板。37 ℃培养箱内培养18 h后，可见菌落形成，选取菌落数在30～300的平板进行计数，取平均值作为菌落数，计算出菌悬液的浓度（CFU/mL）。以细菌菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标，构建生长曲线。

1.7 细菌浊度与活菌计数的相关性分析

用统计方法对5种细菌的OD值与活菌计数之间的相关性进行分析，根据它们之间是否存在显著的相关性，确定是否可以建立数学模型定量的描述细菌浊度和细菌计数的相关性，从而根据建立的曲线回归方程进行相关指标的评估，建立OD值-细菌数对数的曲线回归方程[9]。

2 结果与分析

在培养条件不变的情况下，定时取样测定其在460 nm/600 nm处的OD值（大肠杆菌测定波长采用600 nm，沙门菌的采用460 nm），以生长时间为横坐标，OD值或细菌数对数为纵坐标，构建生长曲线。5条曲线分别包含适应期、对数生长期、稳定期和衰亡期[10]。

对5种菌的OD值与细菌数的相关性进行统计学分析，结果表明它们均存在极显著的相关性（P＜0.01），这表明可以通过建立数学模型定量描述细菌浊度和细菌计数的关系。因此可以根据建立的5种菌曲线回归方程来进行相关指标的评估。

2.1 O8型大肠杆菌

测定O8型大肠杆菌生长曲线，其初始接种菌悬液浓度为3.7×106 CFU/mL。从图1可以看出，该菌生长大致分为4个时期。其中0～ 1 h为适应期，在这个时期内，细菌生长迟缓。2～6 h为对数期，此时细菌数的对数值与时间呈线性关系，细菌数以几何级数增加。6～20 h为稳定期，细菌增加和死亡的数量趋向平衡。20～24 h为衰亡期，表现“负增长”现象，即细菌死亡的数量多于细菌增加的数量。

对O8型大肠杆菌OD600 nm值与细菌数的相关性进行统计分析，结果表明存在极显著的相关性（P＜0.01），在生长期和稳定期细菌菌液的OD值与细菌数之间呈显著相关性，O8型大肠杆菌的OD值与细菌数对数的曲线回归方程是y=2.55x+6.72（r2=0.96）。该曲线的回归相关指数r2=0.96，说明曲线回归方程的拟合度比较高（图2）。

2.2 O139型大肠杆菌

从细菌生长周期中菌悬液OD600 nm值和活菌计数的动态变化中发现，O139型大肠杆菌整个生长阶段有4个时期[11]。其接种初始浓度为3.168×107 CFU/mL，接种后0～3 h，处于适应期，随后进入对数生长期（3～6 h），并持续约3 h，6～16 h为稳定期，这一时期的活菌数最高且维持稳定；16 h后曲线呈下滑趋势，处于衰亡期（图3）。

对O139型大腸杆菌与细菌数的相关性分析，结果表明它们存在极显著的相关性（P＜0.01），因此在生长期和稳定期时，O139型大肠杆菌OD600 nm值与细菌数对数的曲线回归方程是y=1.45x+8.77（r2=0.95），该曲线的回归相关指数r2=0.95（图4）。

2.3 鸡伤寒沙门菌

从菌株的生长曲线可以看出（图5），菌株的适应性很强，初始接种浓度为1.52× 107 CFU/mL，生长迅速，培养2 h后进入对数期，2～6 h为对数期，生长稳定期为6～ 16 h，16 h后出现菌体生物量减少的现象，处于衰亡期。

用统计学方法对鸡伤寒沙门菌OD460 nm值与细菌数之间的相关性进行分析，结果表明它们有极显著的相关性（P＜0.01），在生长期和稳定期鸡伤寒沙门菌OD值—细菌数对数的曲线回归方程是y=4.50x+7.02（r2=0.95），曲线的回归相关指数r2=0.95（图6）。

2.4 鼠伤寒沙门菌

鼠伤寒沙门菌生长的适应期为0～2 h，对数生长期为2～8 h，8 h～16 h进入稳定期，16 h后进入衰亡期（图7）。

对鼠伤寒沙门菌OD460 nm值与活菌计数之间的相关性进行统计分析，结果表明它们之间有极显著的相关性（P＜0.01），在生长期和稳定期鼠伤寒沙门氏菌OD值与细菌数对数曲线回归方程是y=5.59x+7.67 （r2=0.97）。曲线的回归相关指数r2=0.97（图8）。

2.5 鸡白痢沙门菌

从细菌生长周期中细菌悬液OD460值和活菌计数的动态变化中发现，鸡白痢沙门菌整个生长阶段有4个时期。其接种初始浓度为1.18×107 CFU/mL，0～1 h为适应期，1～ 10 h处于对数生长期，10～16 h为稳定期，16 h后为衰亡期（图9）。

对鸡白痢沙门菌OD值与活菌计数之间的相关性进行统计分析，结果表明它们有极显著的相关性（P＜0.01），在生长期和稳定期鸡白痢沙门菌OD值与细菌数对数曲线回归方程为y=9.72x+6.60（r2=0.98），曲线的回归相关指数r2=0.98（图10）。

3 讨论

在细菌培养过程中不断有培养液营养消耗和细菌代谢产物增加，同时死亡细菌的消融产物也会对菌液的OD值产生影响。本试验研究表明，菌液随时间延长OD值不断增加。试验也发现，菌液颜色随培养时间延长变化明显，由棕黄色逐步变为浅黄色。

生长曲线体现了细菌在培养过程中的生长和繁殖规律，不同细菌在相同培养条件下生长曲线不同，相同细菌在不同的培养条件下其生长曲线也存在差异。本研究以O8型大肠杆菌、O139型大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、鼠伤寒沙门菌等为研究对象，通过24 h连续培养，对OD值、细菌数的变化规律和相关性进行分析和探讨。运用统计软件构建OD值和细菌数的直观图，结果表明其与理论图形是一致的。从生长曲线图形中发现整个生长阶段有4个时期，这与相关文献一致[7-9]。

细菌悬液的浓度和细菌菌液的混浊度呈正相关，因此检测OD值能够反映出菌液的浓度，浓度越高，说明生长的细菌越多。从试验中可以看出，随着培养时间的延长，OD值先增大，后逐渐趋于稳定，说明菌液中的菌数也经历了一个先增多、后趋于稳定的过程。试验设立的阴性对照组的OD值为0，从而消除干扰因素。

OD值和活菌计数，两种测定方法在稳定期和衰亡期出现差异，这是因为OD值反映的是总菌浓度，在对数生长期细菌数呈指数增加，死亡菌数很少可忽落不计，而在稳定期尤其是衰亡期，有大量细菌死亡，活菌数逐渐减少而总菌数基本稳定，这就造成了两种测定方法绘制的生长曲线反映的稳定期、衰亡期时间阶段不同。因此在计算世代时间时，应以活菌计数法为准。细菌总数虽然是在稳定期最多，但是在对数生长期细菌形态、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，因此研究细菌性状、药物抗菌作用等选择此对数生长期最好[11-15]。

根据朗伯—比耳（Lambert-Beer）定律，溶液的浓度太高或太低，均能影响测量结果的准确性，因此OD值选择在0.2～1的范围。结合测量的数据，运用Excel软件绘制散点图。由于绘制的散点图的分布情况类似对数函数图形，故选择用y=a+blgx进行拟合。令X′= lgx可将其化为y=a+bX′，其中X′是OD值，y是菌数的对数值，结果表明5种试验菌回归相关指数都不小于0.95，从而说明在这个吸光度的范畴内，细菌菌液的吸光度和细菌菌数具有显著相关性。运用统计学方法对细菌浊度与活菌计数之间的相关性进行分析，结果表明它们之间存在着极显著的相关性（P＜0.01），通过构建细菌浊度与细菌计数的数学模型，可以有效弥补传统计数方法的缺陷。

参考文献

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