不同检测方法对中国猪场仔猪球虫感染情况的对比调查

张择扬　张军　赵永旭

摘  要：猪囊等孢球虫（cystoisospora suis）是一种重要的原生动物寄生虫，可导致幼龄仔猪严重腹泻。对用饱和食盐或尿素溶液处理后的粪便进行显微镜卵囊计数，是鉴定仔猪球虫病感染程度的常用方法。然而，作为一种新型的检测方法，基于分子生物学技术对球虫基因进行荧光定量PCR检测，已经被欧美国家广泛应用。相比于传统的漂浮显微镜检法，该方法具有更高的敏感性和特异性，可以帮助猪场及早发现隐性感染猪，在临床症状出现前进行干预，减少经济损失。本文展示了2022—2023年期间，分别使用荧光定量PCR和漂浮显微镜检法对中国不同地区的  23家猪场的仔猪球虫感染情况进行流行病学调查的结果。

关键词：仔猪球虫病，检测方法，流行病学调查

中图分类号：S855.9+1 文献标志码：A            文章编号：1000769（2023）05-0105-04

养猪生产在本质上是一种生产投资行为，如何保证有效的投资回报率，是养猪生产者应始终关心的问题。从养猪成本占比来看，60％以上的成本来源于饲料投入[1]。被猪采食的饲料要想成为养猪生产者的收入来源——猪肉，都要通过猪肠道这个“加工厂”进行转化。因此，猪肠道的健康直接关乎猪场的经济效益和投资回报率。猪肠道一旦出现问题，轻则营养物质流失，导致饲料浪费；重则机体脱水消瘦，危及生命。刚出生的仔猪抵抗力较弱，该阶段危害其肠道健康的重要“凶手”之一就是猪囊等孢球虫。

1  病原及危害

导致初生仔猪发病的球蟲只有一种：猪囊等孢球虫，其卵囊的形状犹如“双黄蛋”（图1），双层外壳中包含两个孢子囊，通过这一形态学特征可以与其他种类的球虫进行区分。猪囊等孢球虫主要感染1～7日龄哺乳仔猪，感染猪的年龄越小，引发的临床症状和经济损失就越严重。而对于年龄更大的猪，如保育猪、育肥猪及后备母猪等，猪囊等孢球虫的感染力不强。当仔猪摄入有感染力的虫卵后，一般要经历5 d左右的潜伏期，此阶段寄生虫体在仔猪肠道的上皮细胞中生长、繁殖，导致肠道上皮细胞受损、脱落[2]。此时母乳中的蛋白质、脂肪等营养物质将无法被仔猪的肠道吸收，导致仔猪出现腹泻症状。有研究表明，球虫感染导致仔猪断奶体重减少1 kg，达到95 kg屠宰体重所需的时间增加9 d，经济损失约100元/头[3]。

2  材料和方法

2.1 检测样本

根据猪场的规模大小，选择5～20窝的哺乳仔猪。使用一次性聚乙烯或乳胶手套，收集产床上仔猪的粪便于采样管中，每窝一管，混样约10 g，做好标记，其内容包括：窝编号、采样日期、仔猪日龄。采完一窝更换一组手套（图2）。

本试验是为检测仔猪粪便样本中的球虫卵囊。但是，仔猪只有在感染后的第5～7天和第12天才会出现两次排卵囊高峰，因此错误的采样时段会导致检测结果的假阴性。为避免漏检的情况，本试验对7～14日龄仔猪进行第1次采样，间隔7 d后进行第2次采样（图3）。将第1次采样的粪便样本放置于2～8 ℃冰箱中保存，待完成第2次的样本采集后和第  1次采集的样本按窝标号混合送检，全程冷链运输。

2.2 检测方法

从23家猪场中共采集到261份仔猪粪便样本，将每份样本一分为二，其中一份送往某高校检测实验室，由该实验室使用漂浮显微镜检法进行检测；另一份送诗华杭州科学支持与诊断实验室，使用荧光定量PCR法进行检测。

2.3 漂浮显微镜检法

2.3.1 样本处理

将仔猪粪便样本加入到一个容器中，加入足够的饱和食盐水。

2.3.2 搅拌和过滤

将样本和盐水混合均匀，然后用过滤器对样本进行过滤，去除大颗粒物质。

2.3.3 漂浮

将过滤后的样本转移到漂浮器中，随后加入足够的饱和食盐水，使样本在盐水中漂浮。

2.3.4 观察和检测

用显微镜观察漂浮在盐水表面的颗粒，检测是否存在球虫卵或幼虫。

2.4 荧光定量PCR法

2.4.1 样本收集

从疑似感染球虫的仔猪粪便样本中收集适量的样本。

2.4.2 DNA提取

使用商业化的Power Fecal DNA （QIAGEN的试剂盒，从粪便样本中提取球虫的DNA。

2.4.3 PCR反应体系准备

准备PCR反应混合液，包括使用球虫线粒体和核糖体内转录间隔区（internal transcribed space，ITS）基因设计的引物、DNA模板、聚合酶和缺失核苷酸。

2.4.4 PCR反应

将PCR反应混合液置于PCR仪QuantStudio 3  （Thermo Scientific）中，进行一系列的温度循环，包括DNA变性、引物结合和DNA扩增等步骤。

数据读取，根据电脑推送结果，得出试验数据。

3  结果与讨论

检测结果显示，采用漂浮显微镜检法，猪场阳性率为22％，仔猪粪便样本阳性率为3％；采用荧光定量PCR法，猪场阳性率为78％；仔猪粪便样本阳性率为41％（表1）；并且漂浮显微镜检法结果为阳性的样本，荧光定量PCR法也为阳性（表2）。

通过对比两种方法的检测结果，发现荧光定量PCR法在仔猪球虫感染检测中具有明显的优势。首先，在敏感性方面，荧光定量PCR法是检测粪便中的球虫DNA，其球虫卵囊需求数量比传统漂浮显微镜检法的少，因此结果更加敏感。这使得猪场能够及早发现隐性感染猪，即使在临床症状出现之前，也能进行干预，从而减少经济损失。其次，荧光定量PCR法具有更高的特异性。传统的漂浮显微镜检法在卵囊计数过程中存在一定的主观性，容易受检测人员的经验和技术水平的影响。而荧光定量PCR法通过特定引物和探针的选择，可以更准确地识别仔猪球虫的DNA序列，避免了误判和漏诊的情况。第三，荧光定量PCR法还具有更快的检测速度和更高的自动化程度，可以通过自动化设备进行高通量的样本检测，最多一次可以检测96个样本，大大提高了检测效率。

根据吉林农业大学宫庆龙等[4]通过检索1980—2019年的文献显示，猪囊等孢球虫在中国猪场中的流行率为9.1％。杨光友等[5]对四川省猪场调查后发现，猪囊等孢球虫的流行率为18.7％。这些结果均低于本试验中使用荧光定量PCR法获得的42％的流行率。该结果提示，我国猪场球虫的感染率可能显著高于之前的统计数据，传统的漂浮显微镜检法检测由于敏感性较低，导致隐性感染较多，猪场不能及早发现问题。

4  结论

综上所述，本研究结果表明，荧光定量PCR法在中国猪场仔猪球虫病检测中具有明显的优势。它不仅在发现隐性感染猪方面更敏感，还具有更高的特异性、更快的检测速度和更高的自动化程度。因此，在猪场管理中推广荧光定量PCR法作为仔猪球虫病的主要检测方法，以提高疾病的早期检测和控制效果，减少经济损失。

5  挑战与展望

本研究仅在中国不同地区的23家猪场进行了流行病学调查，因此结果可能受到地区和粪便样本数的限制。未来的研究可以扩大样本规模，以进一步验证本研究的结论。此外，还可以探索其他新型检测方法，以提高仔猪球虫病的检测效果和管理水平。

参考文献

[1] CANDIDO POMAR，INES ANDRETTA，ALINE REMUS. Feeding strategies to reduce nutrient losses and improve the sustainability of growing pigs[J]．Frontiers in Veterinary Science，2021，8：42220.

[2] SAMARASINGHE B，JOHNSON J，RYAN U.Phylogenetic analysis of Cystoisospora species at the rRNA ITS1 locus and development of a PCR-RFLP assay[J]．Experimental Parasitology，2008，118（4）：592-595.

[3] National Animal Disease Information Service， Disease A-Z， Coccidiosis in Piglets. https：//nadis.org.uk/disease-a-z/pigs/coccidiosis-in-piglets/ NADIS - National Animal Disease Information Service

[4] GONG Q L，ZHAO W X，WANG Y C，et al．Prevalence of coccidia in domestic pigs in China between 1980 and 2019： a systematic review and meta-analysis[J]．2021，14（1）：248.

[5] 楊光友，曾智勇，郭莉，等．四川省仔猪球虫病的流行病学调查[J]．中国兽医科技，2004，34（3）：31-34.