陆地棉叶片发育相关基因GhRH39 克隆与功能分析

卞英杰，王寒涛，魏恒玲，张蒙，李弈，喻树迅

（中国农业科学院棉花研究所/ 棉花生物学国家重点实验室,河南 安阳 455000）

棉花是我国最重要的纺织原料作物，高产一直以来都是棉花育种的首要目标。 光合作用是棉花产量形成的关键因素之一[1]，叶片发育状况很大程度上决定了光合作用的效率。 因此，研究棉花叶片发育相关基因的表达和功能，明确其在叶绿体光合系统建立过程中的作用，对推动棉花高光效种质资源创新具有至关重要的意义[2]。

叶绿体是植物特有的负责光合作用的半自主性细胞器，具有双层膜结构，存在于叶肉细胞中，能够进行DNA 自我复制，能独立合成自身需要的小部分蛋白质，但绝大部分叶绿体蛋白质由核基因编码。 叶绿体的形成与发育是一个高度复杂的过程[3-4]。 该过程中如果叶绿体基因表达、蛋白质加工与运输、类囊体形成、质核信号转导等任一环节异常， 均有可能导致叶绿体发育不良、光合色素合成受阻。 光合色素是光能吸收和能量转换过程中至关重要的物质，其含量降低会造成光合能力下降，进而导致作物产量和品质降低。

RNA 解旋酶是一类利用ATP 水解产生的能量打开RNA 超螺旋结构的酶， 广泛存在于所有生物体中[5-6]，调控多种RNA 代谢过程，如RNA合成、翻译起始、RNA 剪接、rRNA 加工、核糖体组装、mRNA 输出及降解。 根据其保守序列特征可分为5 个家族， 分别为SF1、SF2、SF3、SF4 和SF5。其中，具有高度保守的氨基酸序列D-E-A-D（Asp-Glu-Ala-Asp，天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸） 的DEAD-box 亚家族是SF2 家族的成员[7]。 DEAD-box RNA 解旋酶亚家族的功能涉及生命活动的各个层面[8-9]。近年来研究表明DEADbox RNA 解旋酶参与叶绿体发育过程。Wang 等[10]利用烟草转移DNA（Transfer DNA，T-DNA）插入突变体鉴定出1 个叶绿体定位的DEAD-box RNA 解旋酶基因VDL， 突变体植株vdl叶片表现斑状失绿，细胞组织学观察发现叶片失绿部分缺少栅栏组织，透射电镜观察发现叶绿体发育受阻，含有大量未分化的质体。孔荣荣[11]利用水稻温敏白化突变体tcd33图位克隆DEAD-box RNA解旋酶基因TCD33。 在20 ℃下，tcd33突变体几乎观察不到完整的叶绿体，并且有大量气泡结构。 对叶绿体发生、光合膜系统建立、光合色素合成相关基因进行荧光定量聚合酶链反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）分析，发现该基因突变影响叶绿体早期发育和光合系统建立等发育过程。 Nishimura等[12]利用拟南芥突变体nara12图位克隆AtRH39。该基因突变造成植株生长缓慢、叶片黄化、光合作用相关酶活性下降，叶绿体基因翻译效率严重降低，但转录过程没有受到影响。 进一步试验证明， 该基因参与了叶绿体核糖体的组装过程，该基因突变影响叶绿体翻译系统正常功能，使叶绿体内蛋白质合成过程受阻， 造成叶绿体发育异常，影响光合系统建立。

为了研究陆地棉中DEAD-box RNA 解旋酶在叶片发育过程中的功能，将拟南芥AtRH39基因编码序列比对到陆地棉基因组，获得同源性最高的基因Gh_D06G1215，并将其命名为GhRH39。本研究对GhRH39进行基本生物信息学分析、表达模式分析以及病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS） 表型分析等， 验证GhRH39基因在叶绿体发育、光合色素合成过程中的功能。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验中所用棉花材料为陆地棉遗传标准系TM-1。基因沉默试验材料在温度为22 ℃、16 h 光照/8 h 黑暗的温室培养；基因表达分析所用材料种植在中国农业科学院棉花研究所东场试验田（河南省安阳县），大田常规管理。 RNA 提取使用北京天根生化科技公司RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒，cDNA 反转录使用宝生物PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒，qRT-PCR 分析使用SYBPremix Ex TaqTM荧光定量试剂盒， 聚合酶为诺唯赞生物公司2×Phanta Master Mix， 测序载体为pCE-Zero 载体，VIGS 干扰表达载体为pYL-156，辅助侵染载体为pYL-192， 大肠杆菌感受态为DH5α 菌株，农杆菌感受态为GV3101 菌株，所用抗生素有卡那霉素和利福平。 引物合成及片段测序由河南尚亚生物技术公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1GhRH39 基因的克隆。 根据GhRH39基因的编码序列在Oligo 7 软件中设计目的基因扩增引物。 将PCR 扩增产物进行胶回收后连接到pCE-Zero 载体上， 转化大肠杆菌感受态DH5α，经PCR 鉴定的阳性菌送往河南尚亚生物技术公司测序，以获得GhRH39序列。

1.2.2生物信息学分析。 使用GSDS 2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/） 进行基因结构展示， 使用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）进 行 蛋白质保守结构域展示， 使用ExPASY 网站Prot-Param 工具（https://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白质基本理化性质，使用ChloroP（http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/） 预测蛋白质亚细胞定位信号，使用PlantCARE 数据库（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行顺式作用元件预测[13]，使用DNAMAN软件进行蛋白质多序列比对，使用MEGA 7 软件构建进化树[14]。

1.2.3取样。 组织表达模式取样包括：大田种植的TM-1 的根、茎、顶芽（以上组织材料均取于五叶期）和花瓣（开花当天）、纤维（开花后10 d）、不同发育时期叶片（五叶期取倒一叶至倒五叶，记为D1～D5）。 VIGS 植株qRT-PCR 分析取样：选取pYL-156:00 植株与pYL-156:GhRH39 阳性植株相同大小的叶片， 以pYL-156:00 空载植株作为对照。 每个样本3 次生物学重复，检测合格后放置于－80 ℃冰箱保存。

1.2.4反转录与荧光定量分析。 将检测合格的RNA 进行反转录，qRT-PCR 反应体系准备和反应程序设定按照试剂盒说明书进行，仪器型号为Applied Biosystems 7500。 内参基因为GhActin，每个反应设置3 个重复， 结果采用2－△△CT计算基因的相对表达量[15]。

1.2.5VIGS 载体构建与侵染试验。 使用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切pYL-156 载体，获得线性载体，从TM-1 叶片cDNA 中克隆到相应基因的VIGS片段。 用同源重组技术将GhRH39的VIGS 片段插入到线性载体，转入大肠杆菌DH5α，挑取阳性单克隆测序，获得正确的单克隆，并用测序正确的质粒转化农杆菌GV3101[16]。 将携带pYL-156:GhRH39、pYL-156:00 （空 载 体）、pYL-156:PDS（阳性对照）和pYL-192（辅助侵染）的农杆菌在含卡那霉素和利福平（质量浓度均为50 mg·L－1）的LB 液体培养基中过夜培养， 至OD600值为1.5～2.0（OD600为600 nm 下的吸光值），离心后用重悬液（2-吗啉乙磺酸0.5 mol·L－1＋乙酰丁香酮200 mmol·L－1＋MgCl20.5 mol·L－1） 重悬菌体，并调整OD600在1.5 左右，常温黑暗下静置3 h，然后分别将pYL-156:GhRH39、pYL-156:00、pYL-156:PDS与pYL-192 菌液等体积混合， 注射到第一片真叶未展平的棉花子叶。

1.2.6色素含量测定。 分别称取pYL-156:00（CK，空载体对照）植株与pYL-156:GhRH39 阳性植株新鲜叶片0.1 g 左右放入离心管中， 加入25 mL 无水乙醇/ 丙酮（体积比1∶1）混合液，将离心管放到4 ℃黑暗条件下过夜，直至叶片完全白化为止，摇匀，取上清液，测定662 nm、645 nm和470 nm 下的吸光值， 试验进行3 次生物学重复， 每个重复测量3 次取平均值。 按Lichtenthaler 等的方法， 计算叶片中叶绿素a（Chlorophyll a，Chla）、叶绿素b（Chlorophyll b，Chlb）和类胡萝卜素（Carotenoid，Car）的含量[17-18]。 叶绿素a 的 含 量CChla＝（11.24×OD662－2.04×OD645）×0.025／m；叶绿素b 的含量CChlb＝（20.13×OD645－4.19×OD662）×0.025／m； 类胡萝卜素的含量CCar＝（1 000×OD470－1.90×CChla－63.14×CChlb）／214×0.025／m，其中OD662、OD645、OD470分别是662nm、645nm、470 nm 下的吸光值，m是鲜叶片质量。

2 结果与分析

2.1 GhRH39 基因克隆与序列分析

根据GhRH39基因的编码序列 （Coding sequence, CDS）设计特异性引物，以陆地棉TM-1叶片cDNA 为模板，克隆得到GhRH39CDS（图1A），通过无缝克隆连接到pCE-Zero 载体上，挑取阳性克隆测序。 该基因CDS 全长1 863 bp（Base pair， 碱 基 对）， 编 码620 个 氨 基 酸。GhRH39（Gh_D06G1215） 定位在D06 染色体31 392 073～31 397 389 bp，由9 个外显子、8 个内含子组成（图1B）。 利用SMART 在线工具对蛋白质进行保守结构域预测， 发现其包含DEXDc（DEAD-like helicases superfamily）和HELICc（Helicase superfamily C-terminal domain）保守结构域（图1C），表明该基因编码DEAD-box RNA 解旋酶。

表1 本研究中涉及的引物信息Table 1 Information of the primers used in this study

2.2 GhRH39 基因基本生物信息学分析

通 过 ExPASY 网 站 ProtParam 工 具 对GhRH39编码的蛋白质的基本理化性质进行分析。 结果显示该基因编码的蛋白质分子式为C3013H4961N871O889S26，共计9 760 个原子，分子质量约为68.44 kD。 理论等电点为9.90，含有63 个带正电的氨基酸残基（精氨酸和赖氨酸），63 个带负电的氨基酸残基（天冬氨酸和谷氨酸）。 其不稳定系数为35.90，小于40，判断该蛋白质较为稳定。该蛋白的脂肪系数为84.58，总平均亲水性为－0.362。 ChloroP 在线工具预测GhRH39 蛋白质含有叶绿体定位信号。 从棉花功能基因数据库（https://cottonfgd.org/）中调取GhRH39起始密码子上游2 000 bp 的序列，使用PlantCARE 数据库对其顺式作用元件进行预测。 该基因启动子区存在光响应、厌氧诱导、茉莉酸甲酯响应、MYB 转录因子结合、醇溶蛋白合成调节与保卫和损伤响应多种类型调控元件。 值得注意的是存在Box4、GA-motif、GT1-motif、LAMP-element 多种光响应元件（表2）。

表2 GhRH39 启动子区顺式作用元件预测Table 2 Prediction of cis acting elements in promoter region of GhRH39

通过NCBI 的蛋白数据库搜索GhRH39 蛋白同源序列， 发现可可 （Theobroma cacao,XP_017981583.1）、拟 南 芥（Arabidopsis thaliana,NP_849348.1）、玉米（Zea mays,NP_001130422.1）、高粱（Sorghum bicolor, XP_002455046.1）、水稻（Oryza sativa, XP_015613578.1）、 小麦（Triticum aestivam,CDM81630.1）中的同源蛋白与GhRH39相似性分别为77%、61%、57%、56%、56%、55%。多序列比对结果显示，GhRH39 及其同源蛋白的DEXDc 和HELICc 两个结构域序列较为保守（图2A）。 系统进化分析表明，GhRH39 与可可中同源蛋白的亲缘关系最近，这与棉花和可可物种亲缘关系最近[19]相一致（图2B）。

2.3 GhRH39 表达模式分析

提取TM-1 不同组织的RNA 并反转录为cDNA 检测GhRH39基因的表达情况。 结果表明，GhRH39基因在根、茎、叶、顶芽、花瓣、纤维等组织中均有一定表达， 发现在叶片中表达量最高，在顶芽表达量次之（图3A）。 为进一步研究GhRH39基因在不同发育时期叶片的表达情况，选取五叶期主茎倒一叶至倒五叶检测其表达量。发现其表达量在倒一叶至倒三叶中逐渐上升，而在倒四叶、倒五叶中下降（图3B），表明GhRH39表达量随着叶片发育进程而变化。

2.4 GhRH39 基因沉默分析

为了探索GhRH39基因在棉花叶片发育过程中的功能，利用VIGS 技术对其进行沉默。阳性对照植株叶片呈白化表型时， 检测后共得到27株阳性株。 qRT-PCR 分析结果表明：阳性沉默株系中GhRH39基因表达显著降低， 沉默效率近40%（图4A）， 并在新生真叶中出现了失绿表型（图4C）。 光合色素含量测定发现，沉默棉株叶片中叶绿素a 和叶绿素b、 类胡萝卜素含量均显著降低（图4B），说明GhRH39的沉默会降低叶绿素、类胡萝卜素含量。

为了进一步探究GhRH39基因沉默对叶绿体发育、光合色素合成的影响，对叶绿体发育相关基因及光合色素合成通路基因进行表达检测。选取的叶绿体发育相关基因包括：类囊体形成相关基因FZL、 叶绿体RNA 聚合酶启动相关基因SIGF、 光系统Ⅱ分解代谢与修复相关基因FTSH1、叶绿体蛋白质降解相关基因CLpR；选取的光合色素合成相关基因包括：叶绿素合成相关基因HEMB1、CHLI、CHLG， 类胡萝卜素合成相关基因PDS。 结果显示GhRH39沉默植株中，叶绿体发育相关基因FZL、FTSH1表达量降低，SIGF、CLpR表达量变化不显著， 说明GhRH39基因表达受到抑制后，叶绿体发育的部分过程受到一定程度的干扰（图5A）。 色素合成相关基因的表达都下降， 说明GhRH39基因对光合色素合成影响较大（图5B）。

3 讨论

植物中解旋酶基因家族是一个庞大的基因家族，除具有持家基因的功能外，在生长发育、抗旱、抗冷、耐盐等许多方面也发挥重要调控功能[20-22]。 Chen 等[23]从二倍体棉种雷蒙德氏棉基因组中共鉴定了161 个RNA 解旋酶基因， 其中包括51 个DEAD-box 解旋酶基因， 亚细胞定位预测显示它们分布在细胞质、细胞核、叶绿体、线粒体等多种细胞器中，说明该家族成员功能的多样性。 He 等[24]通过对72 个PPR-DYW 蛋白进行亚细胞定位预测， 验证了叶绿体定位的GhYGL1d在叶绿体发育过程中的功能。预测显示，GhRH39的N 端具有叶绿体定位信号，说明其可能在叶绿体发育过程中行使功能。 组织表达试验证明，GhRH39在检测的所有组织中都表达，但在叶片中的表达量最高，且GhRH39表达量会随着叶片的发育而变化，进一步证明GhRH39参与了叶片发育。 另外，GhRH39启动子区存在干旱诱导、防卫与胁迫响应及损伤响应等多种与逆境相关的元件，暗示GhRH39可能在逆境响应中发挥一定的功能。

拟南芥中AtRH3、AtRH22、AtRH26、AtRH39、AtRH50 等5 个DEAD-box 成员被证明定位于叶绿体[3,25]，其中只有AtRH39 被证明参与叶绿体发育。AtRH39基因突变体nara12植株矮小，光合作用相关酶类活性降低， 核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/ 加氧酶大小亚基丰度降低。 试验证明AtRH39参与叶绿体23S rRNA 加工过程，该基因突变会造成叶绿体蛋白质合成过程受阻，影响叶绿体发育[12]。 水稻与烟草中DEAD-box 解旋酶基因OsTCD33与VDL基因突变后，叶绿体中形成大量的空泡结构和未分化的质体，DEAD-box 解旋酶可能参与叶绿体膜系统建立的过程[10-11]。GhRH39基因表达受到抑制后，参与叶绿体发育相关的基因表达量出现一定程度的下降，而参与光合色素合成相关的基因表达量全部显著降低，推测GhRH39可能参与叶绿体某些代谢通路，影响叶绿体发育， 进而造成光合色素合成受阻，但对光合色素的合成可能没有直接的调控功能。 类囊体形成相关基因FZL表达量显著降低， 说明GhRH39可能参与了光合膜系统建立的过程。GhRH39 与AtRH39 蛋白相似性为66%， 序列相似性说明功能的相似性，GhRH39可能也参与了23S rRNA 加工过程。

4 结论

从陆地棉中鉴定了1 个DEAD-box RNA 解旋酶基因GhRH39， 位于D06 染色体， 编码620个氨基酸。 表达模式分析表明，该基因在叶片中表达量最高， 且其表达量随着叶片发育而变化。GhRH39基因沉默阳性棉株的叶片中叶绿素含量和类胡萝卜素含量均下降，一些叶绿体发育和光合色素合成相关基因下调表达，表明GhRH39在叶绿体代谢、光合色素合成等叶片发育过程中发挥着一定的功能。